BMP和TGFβ信号转导途径的拮抗剂制造技术

本发明专利技术提供特异性针对ＢＭＰ和ＴＧＦβ／活化素途径特异性Ｓｍａｄ的Ｈｅｃｔ家族遍在蛋白连接酶的独特成员。所述新型连接酶命名为Ｓｍｕｒｆ１和Ｓｍｕｒｆ２。它们分别与Ｓｍａｄ１和５以及Ｓｍａｄ７直接作用，从而调节这些途径的Ｓｍａｄ和其它蛋白的遍在蛋白化、转化和活性。Ｓｍｕｒｆ１干扰ＢＭＰ的生物反应，但是不会干扰活化素信号转导。在两栖动物胚胎中Ｓｍｕｒｆ１抑制内源性ＢＭＰ信号，导致中胚层和外胚层图式形成和细胞命运特化改变。本发明专利技术提供了一种在胚胎发育过程中遍在蛋白化途径和ＴＧＦβ超家族控制细胞命运决定之间的独特调节连接。因此，Ｓｍｕｒｆ１为Ｓｍａｄ１信号转导的负向调节剂，Ｓｍｕｒｆ１因为对Ｓｍａｄ１的作用而阻断ＢＭＰ信号转导。在哺乳动物细胞中，Ｓｍｕｒｆ２抑制ＴＧＦβ信号转导，而在爪蟾中Ｓｍｕｒｆ２阻碍背中胚层形成，导致胚胎前平截。Ｓｍｕｒｆ２与Ｓｍａｄ７形成稳定的复合物，它诱导降解和下调ＴＧＦβ／活化素信号转导。（*该技术在2020年保护过期，可自由使用*）

【技术实现步骤摘要】
获得本专利技术的研究得到国立卫生研究院部分资助，资助号为SR01HD3242902。所以，美国政府对本专利技术拥有一定权益。
技术介绍
实际上，在所有动物门中胚胎发育的关键步骤受细胞与细胞之间的信号或分泌生长因子介导的诱导信号的调节。具体来说，转化生长因子β(TGFβ)超家族成员调节多种细胞和发育过程，例如有丝分裂、细胞分化、胚胎图式形成和器官发生。在脊椎动物胚胎中，各种TGFβ信号影响胚层特化、机体图式形成(body patterning)、细胞生长和分化(1-4)。在两栖动物爪蟾(Xenopus)胚胎中，不同TGFβ成员诱导不同细胞命运，例如活化素、Vgl和nodal诱导胚胎背中胚层特征，例如脊索和肌肉。Vgl和活化素还诱导内胚层特征。相反，骨形成蛋白(BMP)特异性诱导中胚层，例如血液和间充质，并调节外胚层的表皮细胞和神经细胞分化(参见综述(5))。通过Smad家族蛋白使信号由细胞表面受体复合物直接转导至核DNA靶，从而使细胞对TGFβ家族配体产生反应(参见综述(4)、(6)、(7)和(52))。Smad涉及果蝇(Drosophila)Mad(mothers againstdecapentaplegic)以及3种相关的线虫基因Sma2、Sma3和Sma4编码的蛋白。为了统一命名，术语Sma和Mad已经融合为Smad。Smad家族有8个成员。磷酸化Smad1、5和8在Smad4协同作用下功能性介导BMP家族信号转导。Smad2和3是TGFβ和活化素作用的信号转导蛋白。Smad6和7起抑制TGFβ/BMP超家族信号转导的拮抗剂作用。有趣的是，Smad7定位在核内，在TGFβ信号转导的作用下聚集在细胞质中(73)。而且Smad6和Smad7二者的表达受TGFb、BMP、生长因子和细胞因子的调节，因此对Smad信号转导途径产生负反馈调节(53-58)。磷酸化Smad1进入细胞核时，与Smad4形成异源聚合(heteromeric)复合物，而且激活早期应答基因转录。BMP受体也可以通过有丝分裂原活化蛋白激酶发送信号。BMP可能调节细胞周期进程，因此控制间充质干细胞分化。BMP和活化素/TGFβ两个主要途径的信号转导已有详细介绍。两个不同受体亚单位I型和II型跨膜丝氨酸/苏氨酸激酶与配体结合时形成活化复合物。在这两种复合物中，II型亚单位激活I型亚单位，I型亚单位直接磷酸化并激活特定的受体调节的R-Smad蛋白BMP受体针对Smad1和密切相关的Smad5和8，而活化素和TGFβ受体针对Smad1和密切相关的Smad2和3。激活时这些R-Smad与Smad“共同配偶体”Smad4形成异源聚合复合物。该复合物转运到核，在DNA结合蛋白协同下结合到靶基因的启动子上，最后通过募集辅激活物激活转录。第三类抑制性Smad(I-Smad)Smad6和Smad7起阻碍Smad-Smad复合物形成或Smad-受体相互作用的抑制剂作用。I-Smad结合到受体的胞质结构域或直接结合Smad1。该途径所有水平上的组分突变均与胚胎缺陷和各种癌症有关，突出说明该生长因子家族在发育和疾病过程中的重要性(参见综述(4)、(7))。尤其是Smad2和Smad4缺陷与结肠癌和肺癌有关，人Smad4缺陷与胰腺癌有关。Smad不具有内在酶活性。因此，对Smad信号转导的细胞反应性质对细胞内的Smad蛋白水平非常敏感。实际上，细胞表达的Smad蛋白量的微小变化就可改变爪蟾胚胎的细胞命运决定(8-11)。所以，调节细胞中的Smad蛋白水平可用作一种通过TGFβ超家族调节形态发生信号转导的手段。与遍在蛋白共价连接的蛋白修饰被认为是通过蛋白酶体降解靶蛋白的一般信号(参见综述(12)和(13))。选择性遍在蛋白化目标包括转录因子、细胞周期调节蛋白、信号转导蛋白和膜蛋白((12)中的参考文献)。特定目标蛋白的选择性遍在蛋白化和降解可作为控制细胞周期进程、程序性细胞死亡、分化与胚胎发育的重要机制发挥作用。遍在蛋白化途径机能阻碍与疾病和发育异常有关。遍在蛋白连接酶是催化12.5kD多肽的遍在蛋白与目标蛋白共价连接的多聚复合物的组成部分。遍在蛋白与其目标蛋白的连接用作标志通过称为26S蛋白酶体的细胞器蛋白酶解遍在蛋白化蛋白的分子“标志”。至少有3种酶参与遍在蛋白与目标蛋白缀合，即E1、E2和E3。E1酶激活遍在蛋白分子，使其与E2酶结合，然后E2酶直接使遍在蛋白连接在目标蛋白上，或者将其传送到E3遍在蛋白连接酶上。E3识别特定底物而且指导底物遍在蛋白化。Dictyostelium(14-16)和Drosophila(17-21)介绍了遍在蛋白化系统调节发育的几个实例。各种不同系统利用遍在蛋白与受体缀合控制胞吞和信号转导以及通过蛋白酶体和溶酶体介导的降解二者控制受体稳态水平(59-60)。在许多系统中特征鉴定了膜受体的直接遍在蛋白化，但是在某些情况下遍在蛋白依赖性调节似乎不涉及遍在蛋白与受体的直接缀合(61-62)。尽管许多细胞表面受体受遍在蛋白依赖性途径的调节，但是只明确了很少几个与膜蛋白结合而且其作用是使膜蛋白遍在蛋白化的E3遍在蛋白连接酶。Nedd4为C2-WW-HECT结构域E3遍在蛋白连接酶，它可通过与氨氯吡嗪脒敏感型钠通道羧基末端存在的PPXY基元直接结合而调节所述钠通道的转化(63-66)。此外，最近证实FING指蛋白c-cbl具有E3遍在蛋白连接酶的作用，c-cbl结合EGF受体介导遍在蛋白化而且下调受体复合物(67-68)。在这些实例中，膜蛋白遍在蛋白化似乎涉及E3连接酶与目标蛋白的直接相互作用。不知道连接蛋白是否也可起募集E3连接酶至特定受体复合物的作用。迄今控制图式形成中遍在蛋白化的机制和目的仍然难以捉摸。在整个说明书中以数字引用的参考文献列于实施例之后。本文引用的所有参考文献通过引用结合到本文中。专利技术概述本专利技术有利地提供一类涉及BMP和TGFβ介导性活化的调节蛋白。具体来说，这些蛋白调节Smad蛋白和/或在Smad蛋白存在下促进TGFβ受体复合物的降解。通过控制本专利技术蛋白的活性，熟练技术人员可通过例如BMP或TGFβ上调或下调细胞活动。因此，第一方面，本专利技术提供分离的Smurf蛋白、尤其是人Smurf蛋白。在一个实施方案中，Smurf蛋白为Smurf1蛋白。在一个替代性实施方案中，Smurf蛋白为Smurf2蛋白。在具体实施方案中，举例来说，人Smurf1的氨基酸序列见附图说明图10(SEQ ID NO2)，人Smurf2的氨基酸序列见图12(SEQ ID NO4)。本专利技术Smurf蛋白可含有SEQ ID NO2和4描述序列的至少约5个连续氨基酸，优选至少约10个连续氨基酸。本专利技术还提供特异性结合Smurf蛋白的抗体。本专利技术还提供编码本专利技术Smurf蛋白的核酸。在具体实施方案中，所述核酸具有SEQ ID NO1或SEQ ID NO3描述的核苷酸序列。本专利技术还提供在高严格条件下与具有编码Smurf的序列的核酸或其互补序列特异性杂交的寡核苷酸或核酸。这种杂交核酸包括探针(即它们可以标记)、引物(例如用于PCR扩增)、反义核酸、核酶和形成三螺旋的核酸。本专利技术还提供包含编码Smurf的核酸的载体，该载体例如在表达控制序列控制下。还提供带有这种载本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种分离的Ｓｍｕｒｆ蛋白。

【技术特征摘要】
...

【专利技术属性】
技术研发人员：GH汤姆森，J弗拉纳，
申请(专利权)人：纽约州州立大学研究基金会，HSC研究和发展合伙人有限公司，
类型：发明
国别省市：US[美国]