中药诱导骨髓间质细胞分化为神经元样细胞的方法技术

本发明专利技术涉及一种骨髓间质细胞的定向分化技术。本技术包括ｂＦＧＦ预诱导和定向诱导ＭＳＣ向神经元样细胞分化两个步骤：（１）ｂＦＧＦ预诱导：用含有胚牛血清和ｂＦＧＦ的低糖ＤＭＥＭ培养；（２）定向诱导ＭＳＣ向神经元样细胞分化：用含有中药成分的无血清低糖ＤＭＥＭ中诱导。本发明专利技术具有高效、安全性好、来源丰富经济等优点。（*该技术在2022年保护过期，可自由使用*）

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及一种骨髓间质细胞的定向分化技术。骨髓间质细胞(mesenchymal stem cell MSC)属于成体干细胞(AdultStem cell AS细胞)，它具有自我更新，高度增殖和多向分化潜能，它除具有向中胚层来源的组织，如软骨、骨、肌、肌腱和脂肪等组织分化外，还可跨胚层分化，向内胚层神经外胚层来源的组织，如肝、肺和神经元和神经胶质细胞分化。由于MSC取材方便，可大量扩增，而且自身移植可避免免疫排斥反应。故成为组织工程中理想的种子细胞。如果在体外用特殊方法诱导MSC定向向某种组织细胞分化后进行移植。用于治疗某些疾病，如软骨、骨、肌肉及肌腱缺损，帕金森氏病、老年性痴呆、中风和脊髓损伤等疾病有重要意义。目前国内外大都采用β-羟基醇、二甲基亚酚、丁羟基茴谜和维生素A酸等体外诱导MCE向神经元分化。而用中药或中药有效成分诱导间质细胞向神经元分化的技术未见深入研究。本专利技术的目的是研究能诱导间质细胞向神经元分化的中药及用中药或中药有效成分诱导MCE向神经元分化的技术，为将来治疗中枢神经损伤，如帕金森氏病、老年性痴呆、中风、脑缺血和脊髓损伤等疾病奠定基础。三七总皂甙是从五加科人参属植物三七根提取的有效成分，而川芎嗪提取的一种生物碱单体，主要成分是四甲基比嗪，它们都是治疗心脑血管疾病的传统中药，具有活血祛瘀，通脉止血。对受损的视神经和脊髓具有保护作用。本专利技术提出用中药三七总皂甙或川芎嗪等中药成分，在体外诱导骨髓间质细胞向神经元分化的方法，其中包括bFGF预诱导和定向诱导MSC向神经元样细胞分化两个步骤(1)bFGF预诱导用含有胚牛血清和bFGF的低糖DMEM培养；(2)定向诱导MSC向神经元样细胞分化用含有中药成分的无血清低糖DMEM中诱导。其中，bFGF预诱导步骤为用5代以后的MSC以1～3×105/ml接种到6孔培养板中，用含有5～15％胚牛血清和5～15ng/ml的bFGF的低糖DMEM培养12～48h。定向诱导MSC向神经元样细胞分化步骤为用含有中药成分的无血清低糖DMEM中诱导0.5～8h。所述的中药成分为三七总皂甙或川芎嗪。三七总皂甙的浓度为0.1～0.5mg/ml。川芎嗪的浓度为0.05～2mg/ml。本专利技术的优点在于1、高效 免疫组织化学检测约有75％左右细胞呈神经元样细胞特异性标记阳性，但不表达胶质细胞特异性标记，表明该中药中诱导MSC向神经元样细胞分化。2、安全性好 由于分化后的细胞贴壁生长，向来分化的细胞培养一段时间后，死亡或生理状态不佳易于被PBS冲洗去掉。此外，分化后的细胞只含神经元样细胞，不含神经胶质样细胞。将来用于移植时，可免除形成胶质细胞疤痕之忧。3、来源丰富经济 三七总皂甙和川芎嗪均是临床常用治疗心脑血管和中枢神经损伤疾患的药物，来源丰富、价廉、副作用少。下面给出实施例。(1)bFGF预诱导用5代以后的MSC以1～3×105/ml接种到6孔培养板中，用含有5～15％胚牛血清和5～15ng/ml的bFGF的低糖DMEM培养12～48h。(2)定向诱导MSC向神经元样细胞分化用含有0.1～0.5mg/ml的三七总皂甙或0.05～2mg/ml的川芎嗪的无血清低糖DMEM中诱导0.5～8h，间质干细胞胞体增大，伸出细长突起，部分突起交织成网，免疫组织化学显示这些细胞均呈神经元特异性标记，如神经丝蛋白(NF-M)，神经元特异性烯醇化酶(NSE)，微管相关蛋白-2(MAP-2)和巢蛋白(nestin)阳性，而神经胶质细胞特异性标记，如胶质纤维酸性蛋白(GFAP)则呈阴性。权利要求1.一种，其特征在于包括bFGF预诱导和定向诱导MSC向神经元样细胞分化两个步骤(1)bFGF预诱导用含有胚牛血清和bFGF的低糖DMEM培养；(2)定向诱导MSC向神经元样细胞分化用含有中药成分的无血清低糖DMEM中诱导。2.根据权利要求1所述的，其特征在于bFGF预诱导步骤为用5代以后的MSC以1～3×105/ml接种到6孔培养板中，用含有5～15％胚牛血清和5～15ng/ml的bFGF的低糖DMEM培养12～48h。3.根据权利要求1所述的，其特征在于定向诱导MSC向神经元样细胞分化步骤为用含有中药成分的无血清低糖DMEM中诱导0.5～8h。4.根据权利要求3所述的，其特征在于所述的中药成分为三七总皂甙或川芎嗪。5.根据权利要求4所述的，其特征在于三七总皂甙的浓度为0.1～0.5mg/ml；川芎嗪的浓度为0.05～2mg/ml。全文摘要本专利技术涉及一种骨髓间质细胞的定向分化技术。本技术包括bFGF预诱导和定向诱导MSC向神经元样细胞分化两个步骤(1)bFGF预诱导用含有胚牛血清和bFGF的低糖DMEM培养；(2)定向诱导MSC向神经元样细胞分化用含有中药成分的无血清低糖DMEM中诱导。本专利技术具有高效、安全性好、来源丰富经济等优点。文档编号C12N5/08GK1410530SQ0213498公开日2003年4月16日 申请日期2002年10月18日 优先权日2002年10月18日专利技术者李海标, 撒亚莲 申请人:中山大学本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种中药诱导骨髓间质细胞分化为神经元样细胞的方法，其特征在于：包括ｂＦＧＦ预诱导和定向诱导ＭＳＣ向神经元样细胞分化两个步骤：（１）ｂＦＧＦ预诱导：用含有胚牛血清和ｂＦＧＦ的低糖ＤＭＥＭ培养；（２）定向诱导ＭＳＣ向神经元样细胞分化：用 含有中药成分的无血清低糖ＤＭＥＭ中诱导。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：李海标，撒亚莲，
申请(专利权)人：中山大学，
类型：发明
国别省市：81[中国|广州]