体外重建的人红细胞及其制备和在血液代用品中的应用制造技术

技术编号:1725377 阅读:216 留言:0更新日期:2012-04-11 18:40
本发明专利技术涉及体外重建的人红细胞及其制备和在血液代用品中的应用。其中体外重建的人红细胞由血红蛋白、结构蛋白和磷脂构建;具有与天然人红细胞相似的双凹碟盘形态。本发明专利技术体外重建出的红细胞的生理功能和形态接近天然红细胞,具有可变形性、稳定性好、携氧-释氧能力强、去免疫化,而且细胞大小可以控制到纳米级的重建红细胞。本发明专利技术还涉及所述重建红细胞的制备方法和其在血液代用品应用。(*该技术在2022年保护过期,可自由使用*)

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及一种由结构蛋白、磷脂、血红蛋白等体外重建人工红细胞,作为新型血液代用品。本专利技术以结构蛋白、磷脂为基本分子材料协同包封血红蛋白,在体外重建人工红细胞;通过血红蛋白与结构蛋白、磷脂的结合,体外重建出生理功能和形态接近天然红细胞,具有可变形性、稳定性好、携氧-释氧能力强、去免疫化,而且细胞大小可以控制到纳米级的重建红细胞。本专利技术还涉及所述重建红细胞的制备方法和其在血液代用品应用。目前对于用安全、有效的血液代用品的需求也在不断的增大,在临床医学实践中,输液时使用血液受到严格的限制。主要是由于红细胞的天然特性及传播疾病的危险而导致的。传统的人员输血方式存在一系列问题1.天然血液贮存和运输也很困难血液保存时间短,在4℃-8℃条件下最长保存时间为42天,如果长途运输也易造成溶血。2.由于其存在各种病毒包括艾滋病、肝炎等浸染的危险性,虽然献血员经过严格验血筛选,但丙型肝炎的危险性仍是1∶3000,HIV感染是1∶100000~1∶1000000;输血也可引起其他病毒、细菌、寄生虫及其他疾病的传播。3.输血需要供受体配型,否则出现免疫反应,存在不同血型的配伍、特殊血型的缺乏等问题。4.人口老化,健康供血人群不足,某些地区新鲜血液严重缺乏血源相对枯竭严重不足等问题,给临床救治、急救带来严重的困难和挑战;特别是在战争、严重自然灾害、恐怖性突发事件中,仅靠血库供血、人员献血更是难以满足实际需求,因此对血液代用品特别是性能和功能上最接近正常红细胞的“重建红细胞”的需求市场是难以估量的。长期以来,血液代用品的研究一直是基础医学、临床医学和相关学科的研究目标。起初血液代用品主要以补充血容量,弥补由于失血造成的营养物质丢失为目的,通过配伍的营养补液来补充失去的血浆,但这不能够给肌体及时的输送氧,无法纠正失血后人体的缺氧性损伤;能够富积氧气并可在血液中缓释氧的含氟高分子有机物的应用标志着新型血液代用品的出现,目前比较新的血液代用品是将牛、羊血红蛋白在清除其免疫特性后,通过分子之间的交联(cross-linking)形成大分子并在惰性载体上固定化,或通过转基因技术将血红蛋白的表达基因转移到植物中,通过植物获得血红蛋白,在血液循环中模拟正常红细胞中天然血红蛋白的携氧-释氧生理功能,但这种模拟的血液代用品由于没有细胞膜的屏障,易与血液中的许多活性分子作用,诱发一系列异常的副反应,目前所用的血液代替物都含有血红蛋白(hemoglobin),用后病人很多时都会出现血压增加(increased blood pressure)的情况。这是由于用来保持正常血压的NO,跟血红蛋白起反应,NO被耗尽,所以血压上升。目前生物相容性最好的血液代用品应属人工红细胞即用脂质体膜包裹天然血红蛋白分子,或基因重组血红蛋白及化学合成血红蛋白成为人工红血球,大小与红血球相似。但其存在的问题是这类脂质体人工红细胞携氧效率不高,膜易脆,血红蛋白泄漏,存放时间短到十几分钟,长也不过几天。理想的血液代用品是具有正常血液的优点并克服其不足的产品。理想的血液代用品应具备1.高携氧能力、具有优良的流变学性质,可以改善促进微循环;2.当氧张力在正常生理范围内能运送氧;3.具有希望的清除特性;4.无毒副作用;5贮存期较长(目前血液代用品的寿命很短,短则几小时,最长寿命为70几小时,而天然红细胞的寿命则为120天)、无配型需要、输血反应及不激活正常免疫系统功能。目前研制的还没有一种血液代用品具有血液的全部优点。目前血液代用品存在的上述不足的原因是现有的血液代用品均侧重于模拟正常红细胞的生理生化功能如携氧功能,大多数研究者没有认识到模拟正常红细胞力学特性和流变学特性的重要性。天然红细胞主要由血红蛋白、膜磷脂和结构蛋白有机地构成,血红蛋白与结构蛋白、膜脂之间有着密切的结构相关性。在结构蛋白组成中有维持细胞特定形态的结构蛋白、也有负责氧传输的通道蛋白;血红蛋白与结构蛋白通过结合是血红蛋白锚定到膜上,是血红蛋白的构象变化有利于结合氧;结构蛋白又与膜脂通过疏水作用形成最有利于氧传输的通道。正是这种相互的结构关系使红细胞具备优良的可变形性和粘弹性以及正常的携氧-释氧功能。这些结构关系在构架重建人工红细胞的过程中应该是不可忽略的。目前脂质体包封血红蛋白稳定性和携氧功能达不到要求的原因在于,以往的研究忽略了血红蛋白与结构蛋白之间、结构蛋白与膜脂之间的结构关系,以及这种关系对红细胞具有优良可变型性和流变学性质的贡献,而仅仅用膜脂对血红蛋白进行物理性包封。本专利技术所要解决的技术问题之二是提供制备上述体外重建的人红细胞的方法。本专利技术所要解决的技术问题之三是将上述体外重建出生理功能和形态接近天然红细胞的人红细胞用于制备血液代用品。为解决上述技术问题之一,本专利技术采用的技术方案是这样的即一种磷脂-结构蛋白协同包封血红蛋白,体外构建的人工红细胞,包括以下的材料1.血红蛋白源于人、牛、羊、猪等血液制品;或通过构建基因,大肠杆菌或酵母菌等载体表达或分泌得到的产物;或通过转基因技术,由植物载体生产得到的产物。2.结构蛋白源于天然植物蛋白产物;或通过构建质粒、基因扩增及大肠杆菌或酵母菌等载体表达或分泌得到的产物;或源于人、牛、羊、猪等血液制品;所述结构蛋白的分子量为250,000~620,000道尔顿,其紫外吸收光谱为λmax=280(生理盐水);在其凝胶电泳紫外扫描图谱中清晰可见三个蛋白峰,分别占总蛋白峰值的15%~20%、12%~24%和15%~20%。3.磷脂源于天然植物浓缩磷脂,经分离纯化得到产物;或通过微生物发酵技术得到的磷脂产物。上述成分中,结构蛋白和磷脂构成红细胞的细胞膜成分,在细胞膜成分中,按重量百分比结构蛋白占5~40%,磷脂占60~95%;重建的红细胞中,细胞膜成分占5~30%,血红蛋白占70~95%。上述体外重建的人红细胞在大于100倍的电镜下观察具有与天然人红细胞相似的双凹碟盘形态。为解决上述技术问题之二,本专利技术采用的技术方案是分离得到的结构蛋白经过蛋白质纯化系统取得相应的结构蛋白组分;将血红蛋白、结构蛋白经纯化复性后冷冻干燥备用;复合磷脂和磷脂采用精制技术纯化后备用。应用膜磷脂-结构蛋白协同包封血红蛋白,体外制备人工红细胞。工艺流程如附图说明图1所示,具体的制备方法的步骤如下1、将源于植物蛋白或动物血液的结构蛋白的粗制品经过分离纯化、冷冻、干燥得到结构蛋白纯品;2、按比例加入纯化的磷脂或复合磷脂,并加入溶剂,再经过旋转蒸发,获得重构的细胞膜;3、按比例将血红蛋白用生理盐水溶解,缓慢加入重构的细胞膜中,并通过旋转反应器包封血红蛋白;4、将步骤3获得的产物悬浮于含细胞培养液的生理盐水中,孵育培养至少30分钟后,即制得重构的人工红细胞。为解决上述技术问题之三,本专利技术采用的技术方案是用上述体外重建的人红细胞制备的血液代用品中,按体积百分比,重建红细胞占10%~55%,细胞营养液占45%~905%,其中细胞营养液包括生理盐水和蛋白营养液等。本专利技术具有如下的特点及创新1.本专利技术首次提出红细胞体外重建(reconstruction oferythrocyte in vitro)的概念;目前医学上所用的血液代用品包括脂质体包封血红蛋白在内都只能在部分功能和结构上模拟体内正常红细胞。2.本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种体外重建的人红细胞,其特征是:包括以下的材料: (1).血红蛋白; (2).结构蛋白:其分子量:250,000~620,000道尔顿,其紫外吸收光谱为:λmax=280(生理盐水);在凝胶电泳紫外扫描图谱中清晰可见三个蛋白峰,分别占总蛋白峰值的15%~20%、12%~24%和15%~20%; (3).磷脂; 上述成分中,结构蛋白和磷脂构成红细胞的细胞膜成分,在细胞膜成分中,按重量百分比:结构蛋白占5~40%,磷脂占60~95%;重建的红细胞中,细胞膜成分占5~30%,血红蛋白占70~95%。 上述体外重建的人红细胞在倒置显微镜下(100倍)观察具有与天然人红细胞相似的双凹碟盘形态。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员:王翔段建军高玮
申请(专利权)人:重庆飞翔生物技术有限公司
类型:发明
国别省市:85[中国|重庆]

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