用于治疗感染的减毒微生物制造技术

技术编号:1725357 阅读:189 留言:0更新日期:2012-04-11 18:40
双重突变体沙门氏菌属微生物在保持该微生物能够有效引起免疫反应的同时帮助防止微生物的复活。不同特定突变体的结合是有益的。(*该技术在2020年保护过期,可自由使用*)

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及可以用于疫苗组合物的防治微生物或病毒感染的减毒微生物。
技术介绍
十分肯定的是减毒活微生物是非常有效的疫苗;这样的疫苗通常比那些非复制型免疫原引起更强并且持续时间更长的免疫反应。对这一点的一种解释是活的减毒株在宿主中引起局限感染并且模拟天然感染的早期阶段。另外,不象灭活制剂,活疫苗能够诱导可能同其在抗原呈递细胞,例如巨嗜细胞中的复制能力有关的有效的细胞介导反应。将沙门氏菌(Salmonella)减毒活疫苗用作预防动物和人的沙门氏菌病的安全而有效的疫苗已经有了很长的历史。的确,由瑞士血清疫苗研究所生产制造的口服减毒活伤寒疫苗,Ty21a(Vivotif),已经被证明是一种用于预防伤寒的非常成功的疫苗,并且已经在包括美国和欧洲的许多国家得到许可。但是,用化学诱变技术获得的这一菌株的减毒和菌株的减毒基础并不完全清楚。因此,该疫苗在使用剂量(通常是4)和每次给药量所需的活生物数量方面并不理想。现代分子生物技术结合对沙门氏菌致病原因的知识的增长导致鉴定出了对于这种生物在体内生长和存活所必需的数种基因。这就提供了新的用于减毒的靶基因,引出了未来的疫苗菌株可以通过在选择已知的影响毒力的基因中引入确定的非回复突变而被“合理地”减毒的概念,这有利于改进疫苗的开发,尤其是在免疫原性以及应当使用的剂量大小方面。虽然现在已知许多沙门氏菌减毒株,但只有很少可以有资格作为潜在的人用候选疫苗。这可能部分是由于需要平衡疫苗免疫原性和沙门氏菌微生物变成复活的可能性。我们清楚选择合适的减毒目标以得到合适的候选疫苗是不简单的而且不容易被预测。许多因素都可能影响减毒株作为合适的疫苗的合适性,并且进行了许多研究以鉴定出合适的茵株。例如,许多被检测的作为候选疫苗的减毒株导致病人的脓肿或vaccinemia。因此需要开发出一种免疫原性程度高并且减少了微生物菌株恢复成为活性形式的可能性的疫苗。专利技术概述本专利技术是基于发现将一些减毒突变组合物引入到沙门氏菌微生物中能够产生出一种免疫原性程度高并且恢复成为活性形式的危险性低的疫苗。所得到的疫苗菌株显示出了好的副作用方面。根据本专利技术的第一方面,是具有破坏位于Spi2致病岛中的基因表达的一个减毒突变的,以及破坏cipP,ompR,sifA,sseC或ssaB中的任何一个基因的表达的另一个突变的沙门氏菌属微生物。根据本专利技术的第二个方面,是具有一个破坏aro基因表达的减毒突变,以及另一个破坏cIpP或sifA任何一个基因的表达的突变的沙门氏菌微生物沙门氏茵微生物可以用于生产治疗细菌或病毒感染的静脉用或口服药物,例如用于治疗伤寒。专利技术描述本专利技术的微生物和疫苗组合物可以通过现有技术来制备。普通技术人员不需要过度的试验就可以选择出特定的沙门氏菌微生物以及合适的突变。一种优选的微生物是鼠伤寒沙门氏菌(Salmonella typhimurium)。第一套突变株包括第一个位于沙门氏菌致病岛2(Spi2)区域中的基因的突变;该区域在WO-A-9617951中公开。Spi2是位于沙门氏菌染色体上的两个典型致病岛中的一个。Spi2含有数个基因,这些基因编码参与将Spi2编码的毒力相关蛋白(被称作效应器蛋白)运输到沙门氏菌外并且可能是直接进入到象巨噬细胞一样的目标宿主细胞中的III型分泌系统。Spi2的一部分(装置基因)编码III型系统的分泌装置。Spi2对于沙门氏菌对小鼠的致病性和毒力是完全必需的,这一点现在已被世界的不同组织的观察所证实。经口服,静脉和腹膜内给药途径的攻击小鼠的鼠伤寒沙门氏菌Spi2突变体是高度减毒的。在一个优选的实施方案中,Spi2区的基因是装置基因。位于Spi2内的装置基因现在已经被较好地鉴定;例如见Hensel等,分子微生物学,(1997);24(1)155-167。适用于本专利技术的基因包括ssaV,ssaJ,ssaK,ssaL,ssaM,ssaO,ssaP,ssaQ,ssaR,ssaS,ssaT,ssaU和ssaH基因。Spi2区中的突变不一定在一个基因内以破坏其功能。例如,位于上游调节区的突变也能够破坏基因的表达从而导致减毒。基因间隔区的突变也足以破坏该基因的功能。在本专利技术的一个优选的实施方案中,Spi2基因是ssaV并且进一步的突变破坏cipP,ompR,sifA或sseC中的任何一个。在另一个优选的实施方案中,突变破坏ssaT而另一个突变破坏ssaB。Gifford等在微生物遗传学,1993;139913-920中描述了clpP基因,所编码的蛋白是一种应激蛋白酶。OmpR基因在Chatfield等,传染与免疫性,1991;59(1)449-452中作了描述。所编码的蛋白是具有全局调节功能的双成份系统(OmpR-EnvZ)的一个成份,并且也是Spi2中的双成份系统ssrA-ssrB的调节物(Lee等,细菌学杂志,2000;182(3)771-781)Medina等在传染与免疫性,1999;67(3)1093-1099中描述了sseC基因。所编码的产物的功能是未知的。Hensel在分子微生物学,2000;36(5)1015-1023中描述了ssaB基因。所编码的产物是一种已知的Spi2的底物蛋白,并且同巨噬细胞正常的内体运输相互配合。第二套独立的突变体包括一个破坏aro基因的第一个突变。由于aro基因对于存在于沙门氏菌中而不存在于哺乳动物中的生物合成途径是必需的,所以这一突变被称作“营养缺陷型突变”。所以,突变体不能依赖于在受治病人中发现的代谢产物来避免突变的影响。用于营养缺陷型突变的合适的基因包括aroA,aroC,aroD和aroE。在优选的实施方案中,aroC被破坏。第二个突变破坏clpP或sifA基因中的任何一个。上面描述了ClpP。Stein等在分子微生物学,1996;20(1)151-164以及Beuzon等在欧洲分子生物学杂志,2000;19(13)3235-3249中描述了sifA基因。SifA基因的产物参与上皮细胞中含有糖蛋白的溶酶体结构的产生。可以用任何已知的技术将这种突变引入到微生物中。优选地,突变是缺失突变,基因的破坏是核酸被切除引起的。另外,可以通过插入核酸或者点突变来引入突变。将突变引入到特定区域的方法对于技术人员来说是显而易见的。例如,可以通过首先用PCR和高保真度聚合酶扩增靶基因以及侧翼DNA造成基因缺失。然后可以将扩增产物克隆到合适的克隆载体中。当用在反相PCR中时,可以设计PCR引物来删除基因以产生初始构建体。PCR引物应当含有Xbal位点以引入新的限制性位点并且因此提供了基因缺失的标记。然后将缺失构建体转入到自杀载体中再转入到沙门氏菌染色体中。构建体可以通过电穿孔或整合作用进入到所需菌株中,并且重组体含有整合到在同源位点(部分二倍体)的染色体的质粒,用质粒上携带的抗生素抗性标记筛选。自杀载体应当含有编码果聚糖蔗糖酶的sacB基因,当有蔗糖存在时这对许多革兰氏阴性细菌是有毒性的。对蔗糖的选择性因此可以用来分离出导致质粒从染色体上丢失的第二个重组事件发生的茵落,这第二个重组事件会导致两种结果,野生型等位基因的再生或者缺失突变体的产生。然后可以通过菌落-PCR鉴定含有缺失突变的菌落并且通过DNA印迹分析来鉴定缺失。除了这两种突变,沙门氏菌属微生本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种沙门氏菌属(Salmonella)微生物,该微生物含有破坏位于Spi2致病岛内的基因表达的一个减毒突变,和另外一个破坏clpP,ompR,sifA,sseC和ssaB中任何一个基因表达的突变。

【技术特征摘要】
...

【专利技术属性】
技术研发人员:G都甘DW赫尔顿JD桑坦格罗JE舍艾FR布伦南
申请(专利权)人:微科学有限公司
类型:发明
国别省市:GB[英国]

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