大孔脱乙酰壳多糖小珠及其制备方法技术

本发明专利技术涉及大孔脱乙酰壳多糖小珠，它具有大小为５－２００μｍ的孔，这些孔相对较大且均匀分布到小珠表面和核区，以及所述小珠的制备方法包括下列步骤：将脱乙酰壳多糖溶液、脱乙酰壳多糖水溶液或它们的混合物滴加到低温有机溶剂或液氮中；通过由温度差异所致的相分离法调整孔径大小。本发明专利技术的大孔脱乙酰壳多糖小珠比现有基体使细胞培养更有效，因为由于这些小珠具有较大表面积而使细胞能够有效地附着其上，由于这些小珠的三维结构，注射到小珠中的细胞和附着于小珠的细胞能够容易地长期存在，因此它们能够用于研究生产蛋白质、抗生素、抗癌物质、多糖、生理活性物质、动物激素、或植物激素，以及用于研究代谢器官，软骨或骨的替代品。（*该技术在2020年保护过期，可自由使用*）

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及大孔脱乙酰壳多糖小珠，以及制备大孔脱乙酰壳多糖小珠的方法。更具体地，本专利技术涉及细胞附着性、生物相容性和生物降解性均优异的大孔脱乙酰壳多糖小珠，由此用于细胞生长、血管生成和营养扩散，以及制备大孔脱乙酰壳多糖小珠的方法。此外，本专利技术还涉及应用该大孔脱乙酰壳多糖小珠培养动物和植物细胞的方法。到目前为止，已有许多天然聚合物和合成聚合物用作细胞培养的基体。例如，PGA(聚乙醇酸)网用于制备三维、多孔骨替代物，它可以使许多细胞附着到其上，除了能够支持快速组织再生外，它还具有优异的生物可降解性(Vunjak-Nonakovi，G.等，Journal of Biotechnology Progress，Vol.14，193-202，1998)。Du，C.等合成了nHAC(纳-HAp/胶原)(Journal ofBiomedical Materials Research，Vol.44，407-415，1999)。PLLA(聚-L乳酸)成功地用于培养成骨细胞(Lo等，Journal of Biomedical Materials Research，Vol.30，475-484，1996；Evans，G.R.等，Journal of Biomaterials，Vol.20，1109-1115，1999)。应用溶剂-灌制、微粒-沥滤方法，PGA和PLLA能形成网或三维多孔支架结构，软骨细胞能在其上生长(Freed等，Journal of BiomedicalMaterials Research Vol.27，11-23，1993)。并试图从与纤维蛋白原结合的PEG(聚乙二醇)制备的多孔性基体培养成纤维细胞(Pandit，A.S.等，Journalof Biomaterials Application，vol.12，222-236)。应用PLLA或PLGA(聚-D，L-乳酸-共-羟基乙酸)的氯仿溶液喷雾-灌制方法形成的管状PGA，也能成功地培养成纤维细胞，表明其具有改善的抗压强度。为了进行有效的细胞培养，多孔基体最基本的是允许一些细胞在有限的空间内容易且均匀地尽可能附着其上，并且有助于细胞生长。然而，上述基体不能令人满意地符合这些需要。被推荐用来补充上述基体缺陷的是小珠样基体。在外伤情况下对有止血作用的具有生长因子特性的各种生物相容性材料的研究中，发现带正电荷的小珠有更好的止血效果(Wu，L.等，Journal of Surgical Research，vol.85，43-50，1999)。藻酸盐小珠用于培养软骨细胞，细胞培养1-2天后，加入IL-1β(白细胞介素-1β)，促进形成胞外基体(Beekman，B.等，OsteoarthritisCartilage，Vol.5，330-340，1998)。另外，已经从明胶、胶原、透明质酸、纤维素和玻璃研制出用于细胞培养的其他多孔基体。通过加入HEMA(2-羟乙基甲基丙烯酸酯)和EDM(乙二醇二甲基丙烯酸酯)使多孔明胶小珠聚合，并通过反复冷冻和解冻循环使之形成多孔。这种明胶小珠可以允许各种细胞附着于其上。之后，将细胞移植到组织，以便研究组织取代。小珠可以根据材料改变尺寸，但不适用于细胞培养，因为它们的孔径太小，仅为0.7到2.6μm。小珠基体具有这样的优点，即在有限空间内容纳大量细胞，能够使细胞生长良好，并有效释放产物。然而，藻酸盐或明胶制成的小珠基体难以形成理想孔径的小孔，难以使细胞在其上或其中均匀分布。胶原或玻璃制成的小珠，在生物相容性方面较差。因此，考虑到细胞的多功能性和吸附强度，这些小珠不适于用作细胞吸附的基体。为了在通过细胞移植而进行的组织取代研究中有效使用，聚合物需要具有细胞附着能力和生物相容性、生物降解、可塑性和多孔性。合成聚合物在尺寸和形状的可塑性方面优越于天然聚合物，然后它们在生物相容性和生物降解性方面却较差。因此，合成聚合物在直接组织移植时易于造成各种副作用。基于这些原因，对安全且具有广泛用途的天然聚合物的研究很活跃。壳多糖，脱乙酰壳多糖的前体，发现在甲壳类动物例如螃蟹和小虾的贝壳中，昆虫，真菌的细胞壁中，蘑菇和细菌中大量存在。它是彼此经(1→4)-β-糖苷键连接而成的由N-乙酰-D-氨基葡萄糖重复单元构成的聚合物。脱乙酰壳多糖，一种用高浓度碱对壳多糖进行N-脱乙基化而制备的碱性多糖，已知具有比上述合成聚合物更优越的细胞附着性、生物相容性、生物降解性、和可塑性。由于具有这些优点，已经进行了一些尝试用脱乙酰壳多糖作为细胞培养的基体。例如，戊二醛-交联的脱乙酰壳多糖和果糖修饰的脱乙酰壳多糖用作培养肝细胞的基体(Yagi，等，Biological Pharmaceutical Bulletin，Vol.20，No.6，708-710 & Vol.20，No.12，1290-1294，1997)。这些脱乙酰壳多糖基体可以通过将戊二醛或果糖与纯化的脱乙酰壳多糖混合制备，以增强细胞附着能力和形成所需的性状。然而，用这些修饰的脱乙酰壳多糖基体进行的细胞培养不能超越二维培养系统，因为细胞仅被吸附在基体表面。通过各种冷冻干燥技术研制出具有理想孔径的脱乙酰壳多糖薄膜并用于组织培养工程(Madihally，S.V.等，Journal of Biomatials，Vol.20，1133-1142，1999)。这些脱乙酰壳多糖薄膜在提供理想尺寸的孔方面非常有意义，但仍然限于二维细胞培养技术。另外，报道了通过冷冻干燥制备的脱乙酰壳多糖小珠(Tzu-Yang，等，Joumal of Industrial Engineering Chemical Research，Vol.36，3631-3638，1997)。通过将戊二醛交联到脱乙酰壳多糖小珠的氨基残基上而修饰脱乙酰壳多糖小珠，测定显示对镉离子具有高吸附率。在来自USPTO，1999的Wolfgang，G.等的文件中还发现新的脱乙酰壳多糖小珠。他们报道使用非磁性琥珀酸酐使脱乙酰壳多糖小珠附带羧基。将它们与FeCl2反应，然后用过量水冲洗，提供磁性脱乙酰壳多糖小珠，其可以用于纯化蛋白质或吸附磁性材料。由于它们孔径很小，这种多孔脱乙酰壳多糖被用于吸附和/或纯化离子或磁性材料。然而，没有发现使用多孔脱乙酰壳多糖小珠作为细胞培养的基体。基于脱乙酰壳多糖的优秀细胞吸附能力、生物相容性、生物降解性和可塑生，研究它用于制备具有均匀分布的大孔，从而可以很好培养细胞的大孔小珠。本专利技术人经过完全深入的研究，发现脱乙酰壳多糖溶液在有机溶剂中发生相分离，从而大孔脱乙酰壳多糖小珠在其上和其内能够形成均匀的孔，因而完成本专利技术。因此，本专利技术的一个目的是克服现有技术中出现的问题，提供在其上和其内具有均匀孔的大孔脱乙酰壳多糖小珠。本专利技术的另一个目的是提供具有较大表面积从而将细胞吸附到其上的大孔脱乙酰壳多糖小珠。本专利技术的再一个目的是提供在细胞附着能力、生物相容性、和生物降解性方面表现优越的大孔脱乙酰壳多糖小珠，因此用于细胞生长、血管发生和营养扩散。本专利技术的再一个目的是提供制备大孔脱乙酰壳多糖小珠的方法。本专利技术的进一步目的是提供用大孔脱乙酰壳多糖小珠培养动物细胞和植物细胞的方法。图2是细胞尚未在小珠表面和内部培养前，本专利技术的多孔脱乙本文档来自技高网...

【技术保护点】
多孔脱乙酰壳多糖小珠，在其上和其中具有大小范围为５到２００μｍ的均匀孔。

【技术特征摘要】
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【专利技术属性】
技术研发人员：郑曙荣，裴恩姬，权翊赞，崔贵元，
申请(专利权)人：韩国科学技术研究院，
类型：发明
国别省市：KR[韩国]