一种具有蛋白酶活性的酶制造技术

一种ＤＮＡ构建体包含编码表现出蛋白酶活性的酶的ＤＮＡ序列之ＤＮＡ构建体，其中的ＤＮＡ序列包含ＳＥＱＩＤＮＯ．１或２所示的ＤＮＡ序列或与ＳＥＱＩＤＮＯ．１或２所示ＤＮＡ序列具有至少８０％同源性的这些序列的任一类似物。由该ＤＮＡ序列编码的蛋白酶具有酸性的最适ｐＨ值。（*该技术在2014年保护过期，可自由使用*）

【技术实现步骤摘要】

本专利技术是关于一种DNA构建体-它编码一种具有蛋白酶活性的酶、一种生产此酶的方法、一种具有蛋白酶活性的酶以及一种含有此酶的酶制品。蛋白酶是能够分解肽键的酶。发现酸性蛋白酶(即具有酸性最适pH的蛋白酶)由包括哺乳动物和微生物的许多不同生物体产生。例如，发现微生物酸性蛋白酶由细菌菌株，如芽孢杆菌属之种(Bacillus sp.)菌株(JP 01240184)，真菌菌株，如根霉属之种(Rhizopus sp.)(EP 72978)、Schytalidium SP.(JP 48091273)、Sulpholobus sp.和Thermoplasma sp.(WO/90 10072)以及曲霉属之种(Aspergillus sp.)(JP 50121486、EP 82 395)产生。JP 305879公开了一种编码来自雪白根霉(R.niveus)的一种酸性蛋白酶的基因克隆及其重组表达。来自Cryphonectiraparasitica编码一种天冬氨酸蛋白酶的一种基因的克隆和表达被Choi等(1993)、Takahashi等(1991)、Inoue等(1991)描述过。而JP 407 5586公开了来自黑曲霉(Aspergillus niger)的编码一种酸性蛋白酶(蛋白酶A)的基因克隆。Berka等(1990)公开了编码来自泡盛曲霉(Aspergillus awamori)的天冬氨酸蛋白酶曲霉菌素胃蛋白酶A的基因。编码来自米曲霉(Aspergillus oryzae)的天冬氨酸蛋白酶曲霉菌素胃蛋白酶O的基因克隆被Berka等(1993)描述过。编码来自米曲霉的酸性蛋白酶(PEPA)的基因克隆被Gomi等(1993)公开了。酸性蛋白酶在工业上被广泛地应用，例如用于制备食品和饲料、制革工业(如给皮革除毛)、蛋白水解物生产、以及酿酒工业。在许多不同的应用上，尤其在食品和饲料工业中，需要单一成份的酸性蛋白酶。本专利技术的目的是制备单一成份的蛋白酶。因此，首先本专利技术是有关于编码具有蛋白酶活性的酶的DNA序列的DNA构建体，这段DNA序列含有显示于SEQ ID No.1中的DNA序列或者含有与此序列(SEQ ID No..1)至少有80％同源性的类似序称。其次，本专利技术是关于含有编码具有蛋白酶活性的酶的DNA序列的DNA构建体、这段DNA序列含有SEQ ID No..2中的DNA序列或者含有与此序列(SEQ ID No..2)至少80％同源性的类似序列。SEQ ID No.1中的DNA序列编码一种酶，此酶在以下叙述公开中被称为蛋白酶I。而被SEQ ID No.2中的DNA序列编码的酶被称为蛋白酶II。通过数据库的同源性搜寻，已发现SEQ ID No.1和No.2中的DNA序列通常是新的。发现，SEQ ID No.1中DNA序列与已知蛋白酶基因的最高同源性是与黑曲霉酸性蛋白酶A有74.7％的同源性，据测定两者有538个核苷酸的重叠。据测定蛋白酶II基因与米曲霉曲霉菌素胃蛋白酶O基因的同源性最高，为75.5％，两者有343个核苷酸重叠。第三本专利技术是关于含有本专利技术的DNA构建体的表达载体、一种含有该DNA构建体或表达载体的细胞和一种生产具有蛋白酶活性的酶的方法，此方法包括在允许酶的产生的条件下培养所述的细胞并从培养基中回收酶。第四，本专利技术是关于一种具有蛋白酶活性的酶，这种酶由上述定义的DNA构建体所编码，或由本专利技术吉的方法所生产。第五个重要方面，本专利技术是关于一种具有蛋白酶活性的酶，这种酶在pH值小于7.0和高于3％的过氧化氢存在的条件下具有活性。在本文中，有关这种酶所使用的术语“有活性”是指这种酶在上述条件下能水解底物，如在本实施例五所叙述的那样。本专利技术的酶是在pH值小于7.0和高于3％的过氧化氢存在条件下有活性，并且它在实施例五所特定的条件下能从透镜中除去至少80％的溶菌酶。在下列公开中本专利技术的这种酶被叫做“对过氧化氢稳定的蛋白酶”。通常认为这种酶是新的。并且，本专利技术提供了一种具有蛋白酶活性的酶，它在pH值小于7.0条件下有活性并且它对苯丙氨酸-缬氨酸或者赖氨酸-酪氨酸中的肽键具有专一性。术语“专一性”是指在底物是牛胰高血糖素条件下此酶主要断裂这些肽键。在此叙述的蛋白酶I和蛋白酶II是本专利技术酶的优选实施例。这些酶已被发现是酸性蛋白酶，即具有酸性最适pH值的蛋白酶。通过本专利技术就有可能提供高度纯化的蛋白酶，即纯度大于70％，优选大于90％，这正如通过本文的材料与方法部分所叙述的SDS凝胶电泳所测定的那样。最后，本专利技术是关于含有本专利技术酶的酶制品和适于不同目的的酶或酶制品的使用，其中对含蛋白质物质的修饰或降解是理想的。本专利技术的DNA构建体、载体和方法在本文中关于本专利技术中定义的DNA构建体的术语“类似物”理解为包括任何如下DNA序列它编码具有蛋白酶活性的酶并且分别与显示于SEQ ID No.1或No.2的DNA序列至少有80％的同源性。类似的DNA序列可以是一段在下列条件下同与编码蛋白酶DNA具有相同序列的探针进行杂交的DNA序列。在5XSSC中预浸泡并在5XSSC、5X Denhardt’s溶液、50mM磷酸钠、pH6.8和5μg变性声处理过的小牛胸腺DNA的溶液中在-55℃下预杂交1小时，然后在添加了50μCi 32-P-dcTP标记探针的上述溶液中于-55℃杂交18小时，接着在2XSSC、0.2％SDS中于55℃洗三次，每次30分钟。类似DNA序列优选地与SEQ ID No.1或No.2所示的序列至少有90％的同源性。而与所棕序列优选地至少有95％的同源性。类似DNA序列可以是从其它生物体中分离的，也可以是在SEQID No.1或No.2中所示DNA序列基础上制备的，例如通过引进不会产生蛋白酶的另一种氨基酸序列的而只相应于宿主生物体选用密码子的核苷酸取代基，或者通过引进会产生不同的氨基酸序列并进而可能产生不同的蛋白质结构，这种结构能产生具有野生的酶所没有的特性的蛋白酶突变型的构建体或核苷酸取代基。其它可能的修饰例子是在序列中插入一个或多个核苷酸、在序列中的两端之一增加一个或多个核苷酸、或者在序列的两端之一或中间缺失一个或多个核苷酸。再者，优选地，由类似DNA序列编码的蛋白酶会与针对SEQ IDNo.1或No..2所示DNA编码的纯化蛋白酶而产生的抗体具有免疫交叉反应。能够与SEQ ID No.1所示序列类似的DNA序列杂交的核苷酸探针例如可以根据以下DNA序列之一或其组合制备(a)AATTAAGCAT CCTCCATCTT(b)CAAAGCTCAA TCTCGCTAAC(C)TCCCGCTCTT CTCTCGATCT(d)CATCATCCCA ATAACTCGGA(e)CAAAATGAAG ACCTCTGCTC(f)TCTTGACCGC TGGCCTGTTG(g)GCACCGCTGC TATTGCTGCT(h)CCTCTCACCG CGAAGCGCGC(i)ACGTGCTCGC GCTGCCAAGC(j)TGGCACCAGC CGCAAGAGCA(k)AGGGGGGTCT CAAGCCCGGC(l)ACCCAGCGAG GCCATAACCT(m)GACCGGCTCC AAGAACACCG(n)GAGGTACTCG T本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种ＤＮＡ构建体，包含编码表现出蛋白酶活性的酶的ＤＮＡ序列，该ＤＮＡ序列包含ＳＥＱＩＤＮＯ．２所示ＤＮＡ序列或具有与ＳＥＱＩＤＮＯ．２所示ＤＮＡ序列存在至少８０％同源性的类似序列。

【技术特征摘要】
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【专利技术属性】
技术研发人员：H达伯格，S克里斯高，LN安德森，LV考福德，MS高品恩，JB尼尔森，C达姆曼，
申请(专利权)人：诺沃奇梅兹有限公司，
类型：发明
国别省市：DK[丹麦]