一种抗癌基因工程药物的分离纯化方法技术

本发明专利技术是一种抗癌基因工程药物的分离纯化方法，涉及纯化工艺流程，填料的选择，以及各纯化步骤的关键技术参数。它包括如下步骤及工艺条件：用低渗冲击法处理样品、硫酸铵沉淀与凝胶过滤、弱阴离子交换层析、亲和层析，最后获得目标蛋白纯品。所获蛋白纯度高达９８％以上、得率高达４７％以上、工艺操作简单、整个流程耗时少，凝胶柱、亲和柱使用寿命长等为本发明专利技术之优点。（*该技术在2021年保护过期，可自由使用*）

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】
本专利技术是，它属于抗癌药物

技术介绍
本专利技术是指一种利用基因工程技术生产重组人源的A型二磷酸脱氧核苷激酶(即rhNDPK-A reombinant human nuleoside diphsphate Kinase-A)的分离纯化方法。Nm23-H1(no metastasis)基因是1989年分离鉴定的，其对应的蛋白产物便是A型二磷酸脱氧核苷激酶(NDPK-A)。虽然在该基因发现之前就已经开始从生物体内分离纯化NDPK蛋白，但由于受当时技术水平的限制，纯化工艺烦琐且蛋白得率较低。由于生物体内的NDPK含量低(不到1％)而工程菌中的蛋白含量高(可达30％以上)，二者差别显著，在分离纯化方法上也存在许多不同之处。
技术实现思路
本专利技术的一种抗癌基因工程药物指的是重组人源的A型二磷酸脱氧核苷激酶(rhNDPK-A)。专利技术之目的是为了克服现有技术存在的缺陷，提供一种简单高效的分离纯化重组人源的A型二磷酸脱氧核苷激酶(rhNDPK-A)的分离纯化方法。本专利技术的目的可以通过如下措施来达到该方法包括以下步骤及工艺条件步骤一 用低渗冲击法处理样品将发酵后所获菌体用15～30％蔗糖溶解、在0～6℃下放置10～60min，在低温-10～4℃下高速离心(5000～20000rpm)10～60min，去上清，加入5～15mmol/L的磷酸缓冲液溶解，在0～6℃下放置10～60min，在低温-10～4℃下高速离心(5000～20000rpm)10～60min获取上清。步骤二 硫酸铵沉淀，凝胶过滤在步骤一所获得取上清中逐步加入硫酸铵晶体至硫酸铵浓度达10～50％，低温离心(0～10℃、5000～20000rpm、10～60min)得蛋白沉淀，用缓冲液A(由20mmol/L Tris-HCL pH7.5、1mmol/L EDTA pH7.5、2mmol/L MgCl2pH7.5、1mmol/L DTT pH7.5组成)将蛋白质完全溶解，将溶解后的液体用凝胶填料装填柱过滤，柱型为3.5×90cm(直径×高度)的柱子，上样量为10～100ml，洗脱线速度3～30cm/h，收集各个洗脱峰液，通过SDS-PAGE(十二烷基硫酸钠-聚丙烯酸胺凝胶电泳)确定目标蛋白洗脱峰液，目标蛋白带的分子量为17KD左右。步骤三 弱阴离子交换层析将步骤二收集的目标蛋白洗脱峰液体经柱型5×20cm、采用DEAG(二乙基氨基乙基)弱阴离子填料装填的离子柱层析，先用缓冲液A平衡柱子后，上样量为30～200ml经步骤二凝胶过滤后收集的目标蛋白洗脱峰液，洗脱线速度为3～30cm/h，上样完毕后以0.08～0.14mol/L NaCl+缓冲液A、0.17～0.22mol/L NaCl+缓冲液A、0.5～1.0mol/L NaCl+缓冲液A依次进行梯度洗脱，洗脱速度为4～30cm/h，收集0.17～0.22M NaCl+缓冲液A的洗脱峰液，此即为目标蛋白洗脱峰液。步骤四 亲和层析柱型5×12cm、填料为一种蓝色颜料(Cibacron Blue-3GA)，用缓液A平衡柱子后，上样50～500ml经步骤三收集的目标蛋白洗脱峰液体，用0.17～0.22mol/LNaCl+缓冲液A洗脱至基线，换用0.17～0.22mol/L NaCl+缓冲液A+0.5～3mmol/LATP的洗脱液进行洗脱，收集洗脱峰液，洗脱峰溶液脱盐后经冷冻干燥，即可得蛋白干粉，最后获得蛋白纯度达98％，酶活力为800u/mg蛋白。本专利技术之方法具有如下优点(1)所获蛋白的纯度高达98％以上，得率高达47％以上。(2)工艺操作简单，整个流程耗时少。(3)凝胶柱、亲和柱使用寿命长。具体实施例方式本专利技术下面将结合实施例作进一步详述例1步骤一 用低渗冲击法处理样品将发酵后所获菌体用20％蔗糖溶解、4℃下放置20min，低温高速离心(4℃、10000rpm、15min)，去上清，加入8mmol/L的磷酸缓冲液溶解，在4℃下放置20min，低温高速离心(4℃、10000rpm、20min)获取上清。步骤二 硫酸铵沉淀，凝胶过滤将步骤一所获得的上清中逐步加入硫酸铵晶体至硫酸铵浓度达30％，在4℃下离心(10000rpm)15min得蛋白沉淀，用缓冲液A将蛋白质完全溶解。将溶解后的液体用凝胶填料装填柱过滤，柱型为3.5×90cm(直径×高度)的柱子，上样量为50ml重新溶解的蛋白溶液，洗脱线速度10cm/h，收集各个洗脱峰液，通过SDS-PAGE确定目标蛋白洗脱峰液。步骤三 弱阴离子交换层析将步骤二收集的目标蛋白洗脱峰液体经柱型5×20cm(直径×高度)、采用DEAG弱阴离子填料装填的离子柱层析，首先用缓冲液A平衡柱子，然后上样150ml目标蛋白洗脱峰液，流速为8cm/h，上样完毕后以0.12mol/L NaCl+缓冲液A、0.18mol/L NaCl+缓冲液A、0.8M NaCl+缓冲液A依次进行梯度洗脱，洗脱速度为11cm/h，收集0.18M NaCl+缓冲液A的洗脱峰液，此即为目标蛋白洗脱峰液。步骤四 亲和层析柱型5×12cm、填料为一种蓝色颜料，柱平衡后，上样200ml经步骤三收集的目标蛋白洗脱峰液体，用缓冲液A+0.18M NaCl洗脱至基线，换用缓冲液A+0.18M NaCl+2mM ATP的洗脱液进行洗脱，洗脱速度为11cm/h，收集洗脱峰液，洗脱峰溶液脱盐后经冷冻干燥，即可得蛋白干粉，最后获得蛋白纯度达98.4％，酶活力为810u/mg蛋白，蛋白得率为48％。例2步骤一 用低渗冲击法处理样品将发酵后所获菌体用20％蔗糖溶解、4℃下放置20min，低温高速离心(4℃、10000rpm、15min)，去上清，加入8mmol/L的磷酸缓冲液溶解，于4℃下放置20min，低温高速离心(4℃、10000rpm、20min)获取上清。步骤二 硫酸铵沉淀，凝胶过滤将步骤一所获得的上清中逐步加入硫酸铵晶体至硫酸铵浓度达35％，在4℃下离心(10000rpm)10min得蛋白沉淀，用缓冲液A将蛋白质完全溶解，将溶解后的液体用凝胶填料装填柱过滤，柱型为3.5×90cm(直径×高度)的柱子，上样量为60ml重新溶解的蛋白溶液，洗脱线速度10cm/h，收集各个洗脱峰液，通过SDS-PAGE确定目标蛋白洗脱峰液。步骤三 弱阴离子交换层析将步骤二收集的目标蛋白洗脱峰液体经柱型5×20cm(直径×高度)、采用DEAG弱阴离子填料装填的离子柱层析，首先用缓冲液A平衡柱子，然后上样150ml目标蛋白洗脱峰液，流速为8cm/h，上样完毕后以0.1mol/L NaCl+缓冲液A、0.18mol/L NaCl+缓冲液A、0.6mol/L NaCl+缓冲液A依次进行梯度洗脱，洗脱速度为12cm/h，收集0.18M NaCl+缓冲液A的洗脱峰液，此即为目标蛋白洗脱峰液。步骤四 亲和层析柱型5×12cm、填料为一种蓝色颜料，柱平衡后，上样180ml经步骤三收集的目标蛋白洗脱峰液体，用缓冲液A+0.18mol/L NaCl洗脱至基线，换用缓冲液A+0.18mol/L NaCl+2mmol/L ATP的洗脱液进行洗脱，洗脱速度为6cm/h，收集洗脱峰液，洗脱峰溶液脱盐后经冷冻干燥，即可得蛋白干粉，最后获得蛋白纯度达98.8％，酶活力为8本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种抗癌基因工程药物的分离纯化方法，其特征在于该方法包括以下步骤及工艺条件：步骤一 用低渗冲击法处理样品将发酵后所获菌体用１５～３０％蔗糖溶解、０～６℃下放置１０～６０ｍｉｎ，在低温－１０～４℃下高速离心５０００～２００００ｒｐｍ１ ０～６０ｍｉｎ，去上清，加入５～１５ｍｍｏｌ／Ｌ的磷酸缓冲液溶解，于０～６℃下放置１０～６０ｍｉｎ，在低温－１０～４℃下高速离心５０００～２００００ｒｐｍ１０～６０ｍｉｎ获取上清；步骤二 硫酸铵沉淀，凝胶过滤将步骤一所获得的上清中逐 步加入硫酸铵晶体至硫酸铵浓度达１０～５０％，在０～１０℃下离心５０００～２００００ｒｐｍ１０～６０ｍｉｎ得蛋白沉淀，用由２０ｍｍｏｌ／Ｌ Ｔｒｉｓ－ＨＣＬｐＨ７．５、１ｍｍｏｌ／Ｌ ＥＤＴＡ Ｐｈ７．５、２ｍｍｏｌ／Ｌ Ｍｇｃｌ↓［２］ｐＨ７．５、１ｍｍｏｌ／Ｌ ＤＴＴｐＨ７．５组成的缓冲液Ａ将蛋白质完全溶解，将溶解后的液体用凝胶填料装填柱过滤，柱型为３．５×９０ｃｍ的柱子，上样量为１０～１００ｍｌ重新溶解的蛋白溶液，洗脱线速度３～３０ｃｍ／ｈ，收集各个洗脱峰液，通过ＳＤＳ－ＰＡＧＥ确定目标蛋白洗脱峰液，目标蛋白带的分子量为１７ＫＤ左右；步骤三 弱阴离子交换层析将步骤二收集的目标蛋白洗脱峰液体经柱型为５×２０ｃｍ采用ＤＥＡＧ弱阴离子填料装填的离子柱层析，先用缓冲液Ａ平衡柱子后，上样量为３０～２００ｍｌ经 步骤二凝胶过滤后收集的目标蛋白洗脱峰液，洗脱线速度为３～３０ｃｍ／ｈ，上样完毕后以０．０８～０．１４ｍｏｌ／Ｌ Ｎａｃｌ＋缓冲液Ａ、０．１７～０．２２ｍｏｌ／Ｌ Ｎａｃｌ＋缓冲液Ａ、０．５～１．０ｍｏｌ／Ｌ Ｎａｃｌ＋缓冲液Ａ依次进行梯度洗脱，洗脱速度为４～３０ｃｍ／ｈ，收集０．１７～０．２２Ｍ Ｎａｃｌ＋缓冲液Ａ的洗脱峰液，此即为目标蛋白洗脱峰液；步骤四 亲和层析柱型５×１２ｃｍ、填料为一种蓝色颜料Ｃｉｂａｃｒｏｎ Ｂｌｕｅ－３ＧＡ，用缓冲液Ａ平衡柱子后上样５０～５ ００ｍｌ经步骤三收集的目标蛋白洗脱峰液体，用０．１７～０．２２ｍｏｌ／Ｌ Ｎａｃｌ＋缓冲液Ａ洗脱至基线，换用０．１７～０．２２ｍｏｌ／Ｌ Ｎａｃｌ＋缓冲液Ａ＋０．５～３ｍｍｏｌ／Ｌ ＡＴＰ的洗脱液进行洗脱，收集洗脱峰液，洗脱峰溶液脱盐后经冷冻干燥，即可得蛋白干粉。...

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】

【专利技术属性】
技术研发人员：王一飞，罗勇，钱垂文，林锋，张美英，李久香，刘洁生，
申请(专利权)人：暨南大学，
类型：发明
国别省市：81[中国|广州]