新的分布在内质网的蛋白质和含有该蛋白质的糖蛋白异常症治疗药、以及用于编码该蛋白质的DNA以及含有该DNA**制造技术

由具有糖蛋白生成抑制活性的序列表中序列１记载的氨基酸序列构成的蛋白质、其变异体蛋白质、由序列表中序列２记载的核苷酸序列组成的ＤＮＡ、其ＤＮＡ变异体以及使用上述蛋白质和ＤＮＡ的糖蛋白异常症（例如囊性纤维化症）的包括基因治疗在内的治疗药。（*该技术在2020年保护过期，可自由使用*）

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及到具有糖蛋白生成抑制活性的新的分布在内质网的蛋白质(以下称之为ELP(endoplasmic localization protein)或ELP蛋白质)以及编码它的基因。
技术介绍
内质网(endoplasmic reticulum，以下也称为ER)是新生的分泌型或膜结合型糖蛋白折叠和组装场所的重要的细胞小器官。在内质网中，作为承担新生糖蛋白折叠和组装功能的蛋白质到目前为止已知有钙联接蛋白(calnexin)、(肌)钙网蛋白(calreticulin)等。钙联接蛋白是存在于粗面内质网的Ca2+结合I型膜蛋白，其特征为从核苷酸序列推测的分子量为65kDa(573个氨基酸)，含有底物结合结构域的N末端一侧大部分朝向ER内腔，具有C末端89个氨基酸的细胞质结构域，而且在该C末端细胞质结构域中含有磷酸化部位和局限在ER的信号肽(RKPRRE)。参照Wada，I.等人，J.BiolChem.，266，29，19599-19610，1991文献。另外(肌)钙网蛋白也是存在于ER的Ca2+结合可溶性蛋白，特征为分子量为46kDa(400个氨基酸)、C末端含有局限于ER的信号肽(KDEL)，是钙联接蛋白的可溶性同源蛋白。参照Michalak，M.等人，Exp.CellRes.，197，91-99，1991文献。已经了解到钙联接蛋白和钙网蛋白识别糖蛋白的天冬酰胺(N-)结合型糖链的单葡糖基化糖链，与折叠中间体结合，将糖蛋白留在ER中，与成熟蛋白质不结合。这些蛋白质在ER内起着分子伴侣的功能。从以往报道已知钙联接蛋白和钙网蛋白与cystic fibrosis(囊性纤维化症)囊性纤维化跨膜传导调节蛋白(transmembrane conductanceregulator)(以下称为CFTR)、烟碱能乙酰胆碱受体、α1-抗胰蛋白酶、α1-抗胰凝乳蛋白酶、α-胎甲球蛋白、补体3(C3)、脱辅基蛋白β-100、铁转递蛋白、LDL受体、MHC类I、MHC类II、流感凝血素、T细胞受体、integrin、葡萄糖转运蛋白(Glut 1)等各种分泌型或膜结合型糖蛋白的折叠和组装的调控有关，另外对出现折叠异常的异常蛋白质有抑制其表达、分泌的功能。如上所述钙联接蛋白和钙网蛋白在糖蛋白合成的最初阶段由于与糖蛋白的质量管理有关，是生理意义的重要性正在被广泛认识的与糖链有关的功能分子。因此，控制钙联接蛋白和钙网蛋白功能的内源性物质的发现有可能成为治疗囊性纤维化症(CF)、幼年性肺气肿、家族黑蒙性白痴、先天性蔗糖酶异麦芽糖酶缺乏症、家族性高胆固醇血症(familialhypercholesterolaemiaFH)等变异糖蛋白不与钙联接蛋白和钙网蛋白分开，长时间滞留在ER为原因的蛋白质异常症的划时代的治疗方法。例如，发现在大约70％的囊性纤维化症患者的上皮细胞中表达的CFTR的第508位氨基酸苯丙氨酸(ΔF508 CFTR)缺损。这种情况下，ΔF508CFTR由于折叠异常，不能从钙联接蛋白上脱离，一直长时间保持在ER中直至最终被分解，所以CFTR没有出现在细胞膜上。然而如果在使钙联接蛋白功能抑制的30℃以下的温度条件下对ΔF508 CFTR表达细胞进行培养的话，确认在细胞膜上有ΔF508 CFTR的出现。另外通过添加作为化学伴侣的DMSO也看到同样的现象。这些事实表明作为糖蛋白异常症的治疗法使钙联接蛋白和钙网蛋白的功能降低是有效的。
技术实现思路
本专利技术是鉴于上述事实而构思的，提供具有糖蛋白生成抑制活性的新蛋白质、以及编码该蛋白的基因。本专利技术经不懈努力，结果发现了与钙联接蛋白或钙网蛋白不同的具有抑制糖蛋白生成抑制活性的蛋白质以及编码它的基因。就是说本专利技术提供由以下1～5记载的氨基酸序列构成的蛋白质。1.由序列表中序列1记载的氨基酸序列组成的蛋白质。2.由对序列表中序列1记载的氨基酸序列进行置换、缺失或附加一个或多个氨基酸后的氨基酸序列构成的，而且具有糖蛋白生成抑制活性的蛋白质。3.由序列表中序列2记载的核苷酸序列构成的DNA。4.由对序列表中序列2记载的核苷酸序列进行置换、缺失或附加一个或多个核苷酸后的核苷酸序列构成的DNA。5.与上述3或4记载的DNA相对应的反义DNA或其衍生物。另外本专利技术提供含有上述1或2记载的蛋白质的糖蛋白异常症治疗药。其中该蛋白质即使是其药学上容许的盐形式也可以。另外本专利技术提供含有上述3或4记载的DNA的用于治疗糖蛋白异常症的基因治疗药。另外在本说明书中只要没有预先说明，DNA(包括cDNA)是指由有意链和反义链两条链构成的DNA，RNA是指由一条链构成的，反义DNA是指有一条链构成的DNA。以下详细地对本专利技术进行说明。(ELP蛋白质和ELP基因)本专利技术人为了克隆钙联接蛋白的全长使用与其5’末端和3’末端相对应的寡核苷酸引物，以来自人癌细胞株的cDNA为模板，进行PCR，扩增产物经琼脂糖凝胶电泳分离。另外按照常规方法对该cDNA进行克隆，使用Original TA Clonig Kit，克隆于PCR2.1载体，确定得到的DNA的核苷酸序列。另外确定与该核苷酸序列对应的氨基酸序列。由该氨基酸序列组成的蛋白质可以通过将上述DNA整合到适当的载体，使其表达得到。得到的蛋白质就象预料的那样是由256个氨基酸组成，其表观分子量大约是38kDa。前者的核苷酸序列作为序列2，后者的氨基酸序列作为序列1，分别表示在序列表中。以下，将由序列1记载的氨基酸序列构成的蛋白质称之为「本专利技术的ELP」，而由序列2记载的核苷酸序列构成的DNA称之为「本专利技术的DNA」。如下所述对本专利技术的ELP的生理活性进行了研究。首先进行了在经ELP的反义DNA处理抑制正常细胞的ELP表达情况下对于CFTR在细胞膜上表达的影响的研究。结果表明CFTR在细胞膜上表达减少了。另外将ELP基因(本专利技术的DNA)导入正常细胞之后，研究在过量表达情况下对CFTR在细胞膜上表达的影响。结果表明CFTR在细胞膜上表达显著增大。从这些实验结果证实本专利技术的ELP具有抑制糖蛋白生成的功能。另外研究了向表达Δ508CFTR基因(该基因不能表达在细胞膜上具有正常功能的CFTR)的人气管上皮细胞导入ELP基因后使其过量表达情况下对CFTR在细胞膜上表达的影响。结果表明CFTR在细胞膜上表达显著增大，而且表达的CFTR具有正常的功能。从这些实验结果证实本专利技术的ELP基因具有使因基因变异而使新生成的变异糖蛋白与钙联接蛋白没有脱开，停留在ER为原因的糖蛋白生成低下恢复的作用。因此本专利技术的ELP以及本专利技术的DNA在囊性纤维化症、幼年性肺气肿、家族黑蒙性白痴、先天性蔗糖酶异麦芽糖酶缺乏症、家族性高胆固醇血症等变异糖蛋白与钙联接蛋白和钙网蛋白没有脱开，长时间滞留在ER为原因的糖蛋白质异常症的治疗中是有用的。而由对序列表中序列1记载的氨基酸序列进行置换、缺失一个或多个氨基酸后的氨基酸序列构成的多肽，或在序列1记载的氨基酸序列附加一个或多个氨基酸的氨基酸序列构成的多肽也具有上述糖蛋白生成抑制活性。这些多肽链是本专利技术的ELP的变异体蛋白质，只要具有上述糖蛋白生成抑制活性的都包括在本专利技术的ELP中。同样只要由对序列2记载的核苷酸序列进行置换、缺失一个或多个核苷酸后的核苷酸序列构成的聚核苷酸本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种由序列表中序列１记载的氨基酸序列构成的蛋白质。

【技术特征摘要】
...

【专利技术属性】
技术研发人员：甲斐广文，吉武和久，
申请(专利权)人：久光制药株式会社，甲斐广文，
类型：发明
国别省市：JP[日本]