层析材料以及使用该材料的方法技术

本发明专利技术涉及一种用于分离核酸混合物的层析材料，其具有载体以及施加在该载体上的离子交换剂官能团，其特征在于所述载体包括纤维性材料。另外，本发明专利技术还涉及用根据本发明专利技术的层析材料进行核酸分离的方法。（*该技术在2020年保护过期，可自由使用*）

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及用于分离核酸混合物的层析材料以及使用该层析材料分离核酸混合物的方法。在已知的层析法中，使用具有特定粒径和孔径的无机颗粒状层析材料，它们的表面已用硅烷化剂进行改性，以产生固定相。与形成阴离子或者阳离子交换剂的试剂反应，则导致形成最终的层析材料。例如，国际专利申请公布WO 91/05606描述了层析用载体材料，其适合于分离各种的核酸。合适的载体包括硅胶、氧化铝、二氧化钛、多孔玻璃或者树脂。载体材料应具有3-500μm的粒径，孔径为约10-1000nm，而比表面积为5-800m2/g。该颗粒状载体的表面用烷氧基硅烷进行硅烷化。因此，还描述了层析载体材料，其是以硅胶为基础，并具有通过烷氧基硅烷与二级羟胺的反应而得到的阴离子交换剂基团。根据欧洲专利0 104 210，描述了硅胶材料，其粒径为3-100μm，空隙大小为10-1000nm，而比表面积为5-800m2/g。这些材料用硅烷化剂进行表面处理，然后在层析法中与离子交换剂一起使用，用于分离核酸。最后，欧洲专利0744025公开了一种层析材料，其中硅胶载体用硅烷化剂处理，而且所选择的载体材料的孔径为4-6nm。载体的粒径为1-500μm。在使用常规颗粒状层析材料的核酸混合物的层析分离中，已发现进行此等分离是非常耗时的。例如，如果在使用改性硅胶作为层析载体的某些柱中，预期核酸在载体上的吸附时间在重力流动条件下至少为20分钟将是可以接受的。目前已知的层析材料也具有限定的空隙率，这是因为根据主流意见，只有多孔载体，即、具有更大表面积的载体，才能保证负载足够的离子交换剂。但是，该空隙率也具有缺陷核酸分离的质量不是最佳的。这主要是由于以下事实分离期间在混合物中存在的其他物种，如RNA和蛋白质，扩散至孔中，并由此对分离过程产生负面影响。因此，本专利技术的目的是提供一种层析材料，其能够在尽可能最短的时间内进行核酸分离，而且同时实现优异的核酸混合物拆分，并分离出优异纯度的核酸。本专利技术的另一个目的是提供一种分离核酸混合物的方法，其能够在尽可能最短的时间内最大可能地拆分单个组分，并使它们具有尽可能最高的纯度。本专利技术还涉及用根据本专利技术的层析材料分离核酸混合物的方法，其中核酸的层析分离是在力的作用下进行的。最后，本专利技术涉及用于分离核酸混合物的试剂盒，其包含根据本专利技术的层析材料。该试剂盒按照所希望的设置包括根据本专利技术的层析材料、以及在使用所述层析材料进行核酸混合物分离时的相应缓冲液。载体的比表面积在0.05-50m2/g的范围内，优选在1-10m2/g的范围内特别是在1-5m2/g的范围内。适合于改性带有离子交换剂官能团的表面的纤维性材料可用作载体。载体的合适材料例如是微纤维，其中微玻璃纤维是优选的。此等材料具有无孔表面。在优选的实施方案中，纤维性材料可以在用作载体之前进行酸或碱处理。纤维性载体可以块状形式(in the form of amass)直接用于层析法中。但是，在进行分离时也可进一步将该块状载体处理成合适的形式。现已发现，对于许多的应用，根据本专利技术的层析材料可有利地包括膜形式的载体。对于层析材料的合适容量，优选该膜具有至少0.05mm的厚度，而不管总的表面积如何。在根据本专利技术的层析材料的优选实施方案中，该膜为单层的形式。然而，该膜也可以是多层的形式，这取决于所希望的分离容量。根据本专利技术的层析材料的载体与硅烷化剂反应。例如，硅烷化剂可以是国际专利申请公布WO 91/05606中描述的任意一种。同样，阴离子交换剂基团或者阳离子交换剂基团也可按照已知的方法负载于固定相上。其例子描述在国际专利申请公布WO 91/05606中。根据本专利技术的层析材料具有以下优点在使用该材料时，可在极短的时间内分离核酸混合物。其原因在于，即使在强力存在时，例如作用在根据本专利技术的层析材料(其比常规层析材料具有更高的材料密度)上的真空，对于核酸分离仍有足够的保留时间。由于可达到高的材料密度，核酸分离可在非常小的床体积下进行。洗涤和洗脱体积也因此较低。根据本专利技术的层析材料可用于分离核酸混合物，其中所得的馏分具有极高的准确度和纯度。特别是在与常规颗粒状层析材料相比时，证实了这一点。为此，在分离为RNA和DNA之前和之后，使核酸混合物在根据本专利技术的层析材料、以及两种常规层析材料上于琼脂糖中流动。图2显示了使用根据本专利技术的层析材料分离核酸混合物组分。单个泳道显示了柱中的流出物泳道L分离前清除的溶胞产物泳道D柱流动液泳道W1第一洗涤液泳道W2第二洗涤液泳道E洗脱液用常规层析材料进行相同的实验。为此请参考图3和4。在泳道中使用相同的柱流动物。图2显示了在泳道E的洗脱物中，由质粒DNA中完全分离出RNA。另外，可以清楚地看出，在洗脱之前的单独运行没有丢失任何DNA。图3和4显示了使用常规的颗粒状层析材料分离核酸混合物组分。特别是在图3所示的纯制中，表明在泳道E中丢失了大量的DNA。另外，如泳道W2中所示，RNA浓度的贫化较差，其中在第二洗涤流出液中继续存在显著量的RNA。如图4所示，在使用另外一种常规层析材料时，浓度的贫化也很差。泳道W2表明在第二洗涤液中仍存在相当多的RNA。与常规颗粒状层析材料相比，本专利技术层析材料的另一个优点在于在洗脱物E中不存在层析材料(细固体)的颗粒。这使得如此得到的核酸的质量大大提高。根据本专利技术使用本专利技术的层析材料分离核酸混合物的方法的特征在于，在力的作用下进行分离。在优选的实施方案中，本专利技术的方法是在施加真空下进行的。例如，在将核酸混合物施放在根据本专利技术的层析材料上后，施加真空，在约20秒的时间内进行分离。这与常规硅胶柱完全相反，在使用至少10倍的床体积时，其需要的分离时间在重力流动下至少为20分钟。根据本专利技术的层析材料实际上可用于所有的层析法中。这些层析法包括柱层析、自旋柱或自旋杯(spin cup)中的分离、或者大批量的分离，其中层析材料为悬浮液的形式或者吸附在反应容器、微量滴定板、移液管、搅拌棒或者测试条(test strip)上。在自旋杯中进行层析分离时，使用离心力，使得放置在自旋杯上的样品在离心机中进行层析分离。在使用本专利技术的层析材料时，可以非常有效地分离任何核酸混合物。因此，在包含大量RNA外还包含非常少量DNA的混合物中，可分离出纯度极高的DNA。另外，可完全避免使用毒性物质，如苯酚、氯仿或者溴化乙锭。再者，在不使用核糖核酸酶的情况下完整地进行分离。附图说明图1显示了一个装有根据本专利技术的层析材料的层析柱的例子。底部玻璃料(2)的厚度为1mm，密封住出口。该底部玻璃料(2)放置在常规的市售塑料柱(1)中，该塑料柱的出口朝向底部变尖，用于施加真空。在该塑料柱上设置根据本专利技术的层析材料(3)，其为微玻璃纤维膜的形式，厚度为2mm。最后，在塑料柱的顶部设置厚度为1mm的顶部玻璃料(4)。在所有的其他层析法中使用类似的设置，例如在自旋杯中以及在微量滴定板(96孔板)上。根据本专利技术之使用本专利技术层析材料的用于分离核酸混合物的方法以简单的步骤梯度进行，其中包括洗涤负载有核酸混合物的层析装置，然后用合适的缓冲盐溶液洗脱所希望的核酸。在DNA与本专利技术的层析材料结合期间，大多数的RNA被分离，而残留的RNA在洗涤操作期间被洗出。因此，用核糖核酸酶进行处理不是必须的。如果层本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种用于分离核酸混合物的层析材料，其具有载体以及施加在该载体上的离子交换剂官能团，其特征在于所述载体包括纤维性材料。

【技术特征摘要】
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【专利技术属性】
技术研发人员：约亨蒂特根，
申请(专利权)人：蒂特根博士生物技术公司，
类型：发明
国别省市：DE[德国]