用于表达甲病毒复制子的侵袭性细菌载体制造技术

本发明专利技术涉及用于将甲病毒复制子ＤＮＡ传递到动物或动物细胞中的细菌传递系统，所述甲病毒复制子ＤＮＡ编码一个或更多个要在所述动物或动物细胞中表达的异源基因。所述细菌为经工程化以含有一种ＤＮＡ载体的侵袭性细菌或侵袭性减毒细菌，所述ＤＮＡ载体编码在真核表达盒中的所述甲病毒复制子。所述异源基因可编码抗原、治疗剂、免疫调节剂、反义ＲＮＡ、催化性ＲＮＡ、蛋白质、肽、抗体或抗体的抗原结合片段。在一个优选的实施方案中，所述异源基因编码一种或更多种作为ＨＩＶ疫苗的有用抗原。除了细菌传递系统之外，本发明专利技术提供在动物或动物细胞中引入并表达所述异源基因的方法以及刺激或激发免疫应答的方法。（*该技术在2020年保护过期，可自由使用*）

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及用于将甲病毒复制子DNA传递到动物或动物细胞中的细菌传递系统，所述复制子编码待在所述动物或动物细胞中表达的一个或更多个异源基因。所述细菌为侵袭性细菌或侵袭性减毒细菌，所述细菌经工程改造以含有在真核表达盒中编码所述甲病毒复制子的DNA载体。在细菌感染后，该真核表达载体立即驱动所述DNA载体的初级转录，而产生一种甲病毒复制子RNA，该RNA则被运送到细胞质中。为了表达在甲病毒复制子中编码的异源基因，转录所述RNA，且如果该基因编码蛋白质，则翻译它。所述异源基因可编码抗原、治疗剂、免疫调节剂、反义RNA、催化性RNA、蛋白质、肽、抗体、抗体的抗原结合片段或希望传递到动物或动物细胞中的其它任何分子。在一个优选的实施方案中，该异源基因编码一种或更多种作为HIV疫苗的有用抗原。除了细菌传递系统之外，本专利技术还提供在动物或动物细胞中引入并表达异源基因的方法、刺激或激发免疫应答的方法以及用于此目的的疫苗。借助阳离子脂质体、将裸露DNA直接注射到动物肌肉组织中及直接注射到胚胎中、或用“基因枪”技术进行DNA的真皮内注射，已实现了将DNA成功传递到动物组织中。这些技术的局限是它们仅有效地传递DNA到非肠道的部位。目前，有效传递真核表达盒至粘膜组织已获得了有限的成功。这大概是由于口服传递时很少进入到这些部位、传递载体的毒性或传递载体的不稳定性所致。至于基于DNA的疫苗接种，通过注射裸露质粒DNA的传递已在小鼠模型中显示了既诱导体液免疫应答又诱导细胞免疫应答的潜力。然而，在较大的动物中，为了接种而采用DNA传递则因需要大量的DNA或诱发有可能产生对其耐受性的抗原的持续表达而受到阻碍。Berglund报道了一种通过用质粒DNA注射小鼠而诱发或增强免疫应答的策略；所述质粒DNA包含甲病毒DNA表达载体，该表达载体具有一个在真核表达盒中的重组塞姆利基森林病毒(Semliki Forest Virus)(SFV)复制子。该真核表达盒控制SFV复制子的初级核转录的表达。编码异源抗原的这种SFV复制子的转录物被转运到细胞质中，并由自身编码的SFV复制酶复合物扩增SFV复制子的转录物。经扩增的RNA复制子导致产生高水平的编码所述异源抗原的mRNA。Polo和他的研究小组描述了类似的结果。这两个研究小组都发现，用少量输入的质粒DNA能诱导强烈的免疫应答。虽然这种方法允许较多的来自输入DNA载体的表达，但该方法仍有与非肠道传递相关的缺点。另一方面，传递DNA到动物的、克服传统传递方法缺点的方法是给予包含细菌DNA载体的侵染性减毒细菌；所述细菌DNA载体具有编码待表达的基因的真核表达盒。例如，PoweII等的美国专利第5,877,159号描述了能侵入动物细胞而不建立生产性感染或致病的活细菌，由此引入能被所述动物细胞表达的、编码抗原的真核表达盒。虽然这种方法允许传递该DNA疫苗到粘膜表面且容易给予(这是在发展中国家里对疫苗传递的所关注的一个问题)，但它不具有提供编码所关注基因的可扩增的mRNA的优点。因此，本专利技术联合使用减毒的侵染性活细菌和编码甲病毒复制子的真核表达盒，以提供改良的细菌传递系统来传递一种或更多种异源基因到动物中。这样的系统既有细菌传递系统的优点、又有甲病毒复制子载体的优点，并且是有效的、成本有效和安全的。对于传递用于基因治疗和疫苗接种的DNA，本专利技术的细菌传递系统是特别有用的。通过引用，将引用的所有文献和专利通过引用全部结合到本文中。所述异源核酸序列可编码抗原、蛋白质的抗原性片段、治疗剂、免疫调节剂、反义RNA、催化性RNA、蛋白质、肽、抗体、抗体的抗原结合片段、或可由DNA编码的且希望传递到动物或动物细胞中的其它任何分子。从选自流感病毒、呼吸道合胞病毒、HPV、HBV、HCV、HIV、HSV、FeLV、FIV、HTLV-I、HTLV-II和CMV的病毒中，可以得到所述的异源核酸序列。所述病毒序列能编码一种或更多种病毒基因或其抗原性片段。所述异源核苷酸序列可以编码细胞因子、白介素、红细胞生成素或其它免疫刺激蛋白或免疫调节蛋白。本专利技术的另一个实施方案涉及一种通过用侵染性活细菌、尤其是减毒的侵染性细菌感染在动物体内引入和表达基因的方法。这些细菌含有一种包含真核表达盒的DNA，该真核表达盒具有一段能以RNA形式在所述动物细胞中扩增的甲病毒复制子DNA。而且，所述甲病毒复制子DNA指导一种或更多种编码待在所述动物中表达的基因产物之异源核酸序列的表达。该方法适用于传递编码抗原、抗原性蛋白片段、治疗剂、免疫调节因子、反义RNA、催化性RNA、蛋白质、肽、抗体、抗体的抗原结合片段、或可由DNA编码的且希望传递到动物或动物细胞中的其它任何分子的基因。本专利技术的另一方面提供一种用侵染性活细菌感染动物而在所述动物体内诱导免疫应答的方法，所述细菌包含一种DNA，该DNA包含一个与能以RNA形式在动物细胞中扩增的甲病毒复制子DNA有效连接的真核表达盒；其中，所述甲病毒复制子DNA编码至少一种抗原或蛋白质的抗原性片段。以足够激发针对抗原或抗原性片段的免疫应答的水平，表达所述抗原或抗原性片段。在一个优选的实施方案中，所述抗原来源于病毒，且更优选来源于HIV病毒。这一方法提供一种使动物且最好是人免疫的手段，从而防备HIV的感染。在一个优选的实施方案中，该甲病毒复制子DNA编码至少一种来自HIV基因env、gag、pol、nef、tat和rev中的每一基因的抗原或抗原性片段。本专利技术的再一方面涉及一种在动物细胞中引入和表达基因的方法，即通过(a)用侵染性活细菌感染该动物，所述活细菌包含一种或更多种DNA分子，其中所述DNA分子包含一个与能以RNA形式在所述动物细胞中扩增的甲病毒复制子DNA有效连接的真核表达盒；且所述甲病毒复制子按次序地包含至少一种有效连接到异源核酸序列上的核酸控制序列，以控制其表达；和(b)在足以表达由所述异源核酸序列编码的基因产物的条件下，培养这些细胞；由此在动物细胞中引入和表达基因。专利技术详述当用于本文时，“侵染性细菌”为能够传递真核表达盒到动物细胞或动物组织中的细菌。“侵染性细菌”包括天然能进入动物细胞的细胞质或细胞核的细菌，以及为了进入动物细胞或动物组织中之细胞的细胞质或细胞核而被遗传工程化的细菌。本专利技术的侵染性细菌感染宿主，而不在所感染的宿主中建立生产性感染和/或致病。在侵染性菌株可能引起动物疾病或对所述动物产生问题或健康危险的情况下，可以修饰该菌株，或将其减毒；使得它可用于本专利技术。因此，“减毒的侵染性细菌”是本专利技术的侵染性细菌，它们也能够感染动物宿主，而不在所感染的宿主中建立生产性感染和/或致病。减毒的细菌菌株至多可引起限于临床上无关紧要的自限性感染。减毒一般指的是相对于参照菌株而言感染能力减弱。因此，用本
已知的方法，可制备本专利技术的减毒细菌。例如，或者用化学方法，用诱变剂例如N-甲基-N’-硝基-N-亚硝基胍，或者用重组DNA技术，可以运用非特异性诱变，将减毒突变引入到细菌病原体中；所述重组DNA技术为经典的遗传学技术例如Tn10诱变、P22介导的转导、λ-噬菌体介导的交换以及接合转移，或用重组DNA技术的定点诱变。优选重组DNA技术。这样的减毒突变的实例包括但不限于(i)营养缺陷突变，例如aro突本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种细菌传递系统，所述细菌传递系统包括侵染性活细菌，所述细菌包含一种ＤＮＡ，所述ＤＮＡ包含一个与能以ＲＮＡ形式在动物细胞中扩增的甲病毒复制子ＤＮＡ有效连接的真核表达盒；其中，所述甲病毒复制子ＤＮＡ包含至少一种有效连接到异源核酸序列上的核酸控制序列，以控制所述异源基因的表达。

【技术特征摘要】
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【专利技术属性】
技术研发人员：J古德斯密特，JC萨多夫，W科夫，
申请(专利权)人：国际艾滋病疫苗行动组织，
类型：发明
国别省市：US[美国]