β－环糊精蚓纤溶酶修饰酶的制备方法技术

本发明专利技术以蚯蚓血纤蛋白溶酶为原材料，用β－环糊精进行化学修饰。修饰酶（β－ＣＤＥＦＥ）的稳定性得到提高。经药代动力学实验证明，β－ＣＤＥＦＥ在体内的分布相半衰期为１ｈ，是ＥＦＥ的１．５２倍。β－ＣＤＥＦＥ对底物（酪蛋白）的亲和力为ＥＦＥ的３．５倍。（*该技术在2021年保护过期，可自由使用*）

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及到修饰酶的制备，尤其是β-环糊精(β-CD)修饰蚯蚓血纤蛋白溶酶(EFE)后形成的β-环糊精蚯蚓血纤蛋白溶酶修饰酶(β-CDEFE)。血栓病、心血管疾病是一类严重危害人类健康的多发性常见疾病。目前市售的降纤酶、蝮蛇抗栓酶、尿激酶等药物虽已用于临床，但稳定性差、易失活，体内停留时间短、不易进入病灶细胞(组织)、价格昂贵，易导致出血等临床缺限，未及普遍推广应用。寻找有效的治疗药物是国内外医学界关注的热点。蚯蚓俗称地龙入药在国内已有1200余年历史，并沿用至今。蚓体内，治疗上述疾病的主要有效成分是蚓纤溶酶(EFE)。目前市售的“9·12”胶囊、地龙胶囊、溶栓胶囊等在临床同样存在上述弊病，基于口服，疗效更低。一般酶制剂用于临床必须是(1)在体内的半衰期长；(2)无免疫原性；(3)易进入细胞和组织。为此，寻找新的溶栓药源及其新剂型是当前国内外研究的热点。本专利技术的目的在于寻找一种来源广泛、制备简便、稳定性好、应用范围广的溶解血纤蛋白的新药源，以适应经济发展的需要。蚯蚓是世界环保动物，不仅是珍贵的药材、优良的新蛋白食品和饲料，而且在土壤改良、消除公害、保护生态环境上，在物质循环、生物多样性等方面发挥特殊作用。本项发现，不仅增加了药物新资源、新品种，而且对带动蚯蚓养殖业、加工业及其研究的深入发展具有显著的经济和社会效益，同时对脱贫致富、培育三高农业、改良生态环境等方面也有十分重要的意义。我们于上世纪九十年开始对蚯蚓溶纤酶进行研究。近几年来，用β-环糊精对蚯蚓溶纤酶进行化学修饰，制备出高活力的β-环糊精蚓溶纤酶修饰酶(β-Huan hu jing xiu shi Qiu yin Xue xian dan bai rong mei)，英文名缩写为β-CDEFE)。本专利技术是这样实现的β-环糊精蚓溶纤酶修饰酶(β-CDEFE)的制备将蚯蚓血纤蛋白溶酶加入β-环糊精溶液中，均匀后，在30～50℃恒温水浴中，间歇搅拌40-70分钟，再在32℃以下搅拌8-14小时，反应后的溶液即为β-环糊精蚯蚓血纤蛋白溶酶修饰酶。反应中β-环糊精与蚯蚓血纤蛋白溶酶的比例为1∶4(体积比)。β-环糊精浓度对修饰效果的影响将β-环糊精按浓度梯度加入到4ml一定酶浓度(如600U/ml)的蚯蚓血纤蛋白溶酶溶液中，45℃恒温水浴1h，间歇搅拌，然后冷却至室温。超声波处理10min，室温下磁力搅拌器搅拌10s，重复此过程2-3次，再在室温搅拌过夜，得到β-环糊精蚯蚓血纤蛋白溶酶溶液。测其相应活性变化，酶蛋白浓度为1.5mg/ml，以不加β-环糊精酶液的活力为100％。结果如下表1β-环糊精(mg/ml) 0.51 3 5 7 9修饰酶相对活力(％)86.36 86.50 85.90 86.75 86.10 85.80表1由表1可见，不同β-环糊精浓度对蚯蚓血纤蛋白溶酶的活性影响不大，以5mg/ml为最佳。溶液酶浓度对修饰效果的影响将β-环糊精浓度为5mg/ml加入到酶浓度梯度从300-600U/ml的4ml酶液中，45℃恒温水浴1h，间歇搅拌，然后冷却至室温。超声波处理10min，室温下磁力搅拌器搅拌10s，重复此过程2-3次，再在室温搅拌过夜，得到β-环糊精蚯蚓血纤蛋白溶酶溶液。测其相应活性变化，以不加修饰剂的蚯蚓血纤蛋白溶酶相应浓度的酶液为100％，β-环糊精浓度为5mg/ml。结果如表2溶液酶浓度(U/ml) 300 400500600修饰酶相对活力(％) 86015 85.10 86.25 88.00表2由表2可见，溶液酶浓度对修饰效果影响不大，浓度较高，其效果较好。以下实验的酶浓度为500U/ml。本方法的回收率达85％。产物为液体酶制剂。冻干后，成粉末，为固体酶制剂，此制品易溶于水，水溶液为无色、透明，具有蛋白质性质。β-环糊精蚯蚓血纤蛋白溶酶修饰酶的特性特征1.物理特性正品为无色、无味、无毒、透明水溶液，具有蛋白质性质。冻干后的固体酶制剂为白色粉末，水份和灰份(常规法)分别小于7％和5％。2.酶性质该酶稳定性好，在室温下活力稳定，可在室温下操作。β-环糊精蚯蚓血纤蛋白溶酶修饰酶的Km(米氏常数，底物为酪蛋白)为0.028％(质量百分数)；是蚯蚓血纤蛋白溶酶的0.098％的1/3.5。即β-环糊精蚯蚓血纤蛋白溶酶修饰酶对底物的亲和力比原蚯蚓血纤蛋白溶酶提高了3.5倍。β-环糊精蚯蚓血纤蛋白溶酶修饰酶对pH的稳定性和反应最适pH分别为pH5.8～10.6和pH10.0；分别较原蚯蚓血纤蛋白溶酶的pH5.8～10.6、pH7.8有所提高。β-环糊精蚯蚓血纤蛋白溶酶修饰酶的热稳定性和作用最适温度，酶活力在30～60℃范围内活力稳定，较原蚯蚓血纤蛋白溶酶的30-55℃有所提高；其最适温度为60℃，也较原蚯蚓血纤蛋白溶酶的55℃有所提高。β-环糊精蚯蚓血纤蛋白溶酶修饰酶经药代动力学研究证明，在体内的分布相半衰期为1h，是原蚯蚓血纤蛋白溶酶的1.52倍。β-环糊精蚯蚓血纤蛋白溶酶修饰酶活力为818U/ml，比活力为1788.8U/mg蛋白质。β-环糊精蚯蚓血纤蛋白溶酶修饰酶和蚯蚓血纤蛋白溶酶活力测定1.以酪蛋白为底物称取1g酪蛋白，加入约80ml 0.02mol/L pH7.8磷酸缓冲液，在60℃水浴中溶解后，用同一种缓冲液定容至100ml。吸取0.5ml酶液于37℃保温10min，然后加入同样保温的酪蛋白溶液2ml，摇匀，37℃水浴准确保温15min后，立即加2ml 10％三氯乙酸水溶液终止反应。室温下静置30min，过滤，滤液于280nm波长下测定吸光值。以上述条件下，吸光值(A280nm)改变0.001个单位的酶量为1个酶活力单位(U)。2.以苯甲酰-L-精氨酸己酯(BAEE)为底物称取27.4mgBAEE溶于PBS(浓度为0.4×10-3mol/L)，取2ml BAEE于比色皿中，加待测酶液30～50μl，立即混匀，于253nm波长下测定光密度(A253nm)增加值。以在上述条件下，每min增加0.001个光密度单位的酶量为1个BAEE酶活力单位(U)。蛋白质含量测定按Bradford法，以牛血清白蛋白为标准蛋白质。配制蛋白质从0～900μg/ml的标准水溶液，将上述所配的各浓度标准蛋白质溶液分别吸取0.1ml于试管，各加入5ml考马斯亮蓝G-250溶液，摇匀后，在595nm波长下，以蛋白质浓度为零，即以0.1ml蒸馏水代替蛋白质溶液，作空白管调零。测定各管A595nm，以蛋白质浓度为横坐标，A595nm为纵坐标作标准曲线。以同样方法测定样品的A595nm，从标准曲线上查得样品溶液的蛋白质浓度。本专利技术的优点(1)本专利技术的最基础原料为蚯蚓，原料来源容易，廉价，并且会带动蚯蚓的综合利用；(2)工艺生产设备投资少；(3)修饰酶热稳定性和pH稳定性均强于原酶；(4)修饰过程较为简单；(5)修饰酶活力高，达1788.8U/mg蛋白质。实例吸取1ml浓度为5mg/ml的β-环糊精溶液，加入到4ml浓度为500U/ml的蚯蚓血纤蛋白溶酶中，混匀。45℃恒温水浴1h，间歇搅拌。然后冷却后搅拌12h，得到β-环糊精蚯蚓血纤蛋白溶酶修饰酶液体酶制剂，活力回收86％。冻干后，成粉末，可溶于水，水溶液为无色、透明，具有蛋白质本文档来自技高网...

【技术保护点】
β－环糊精蚯蚓血纤蛋白溶酶修饰酶（β－ＣＤＥＦＥ）的制备方法，其特征在于将蚯蚓血纤蛋白溶酶加入β－环糊精溶液中，均匀后，在３０～５０℃恒温水浴中，间歇搅拌４０－７０分钟，再在３２℃下搅拌８－１４小时，反应后的溶液即为β－环糊精蚯蚓血纤蛋白溶酶修饰酶。反应中β－环糊精与蚯蚓血纤蛋白溶酶的比例为１∶４（体积比）。β－环糊精的反应浓度为０．５－９ｍｇ／ｍｌ。蚯蚓血纤蛋白溶酶的反应浓度为３００－６００Ｕ／ｍｌ。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：高向阳，徐凤彩，詹福建，伍晓斌，谢晓生，
申请(专利权)人：华南农业大学，
类型：发明
国别省市：81[中国|广州]