尿苷二磷酸葡萄糖:糖苷配基一葡糖基转移酶制造技术

本发明专利技术提供了编码将氰醇、萜类化合物、苯基衍生物或者己醇衍生物偶联到葡萄糖的尿苷二磷酸（ＵＤＰ）葡萄糖：糖苷配基－葡糖基转移酶的ＤＮＡ分子。相应基因在植物中的转基因表达能用于影响相应的糖苷的生物合成。（*该技术在2020年保护过期，可自由使用*）

【技术实现步骤摘要】

本专利技术提供了编码将氰醇、萜类化合物、苯基衍生物或者己醇衍生物偶联到葡萄糖的尿苷二磷酸(UDP)-葡萄糖糖苷配基-葡糖基转移酶的DNA分子。相应基因在植物中的转基因表达能用于影响所对应的糖苷的生物合成。在双色高粱(Sorghum bicolor)黄化苗中研究了蜀黍苷的生物合成途径，并发现涉及两种膜结合多功能细胞色素P450。氨基酸前体L-酪氨酸被CYP79A1(P450TYR)酶羟基化两次，形成(Z)-对-羟基苯乙醛肟(WO95/16041)，其随后被CYP71E1(P4500x)酶转化为氰醇对-羟基苯乙醇腈(WO 98/40470)。所述酶的转基因表达用于改变、重建或者新建在植物中生氰糖苷的生物合成途径或者改变芥子油苷的产生。在蜀黍苷的生物合成中，氰醇对-羟基苯乙醇腈与对-羟基苯甲醛和氰离子在生理pH下形成平衡，并且通过UDP-葡萄糖糖苷配基-葡糖基转移酶偶联到葡萄糖。植物具有很强的将广泛的不同化学结构葡萄糖基化的能力，但是植物中葡糖基转移酶存在的数目和底物特异性的范围绝大部分都不知道。早期研究表明窄的和宽的底物特异性都能被发现。不幸的是，在分离葡糖基转移酶至均质时不丧失其生物活性中遇到了困难，使前景暗淡。遇到的困难部分反映了许多葡糖基转移酶分子量相似、不稳定、并且以微量存在。然而超过一百种不同的编码推断的、次级植物代谢葡糖基转移酶的cDNA已描述于公众可进入的数据库，仅仅证实了几种蛋白质。没有从生氰植物中分离氰醇葡糖基转移酶的报道。本专利技术证实UDP-葡萄糖苯乙醇腈-葡糖基转移酶和CYP79A1酶及CYP71E1酶在转基因植物中都表达，使这些植物催化氨基酸酪氨酸向生氰的蜀黍苷的转化。因此，催化涉及生氰糖苷在植物中生物合成反应的蛋白质组合表达实际上建立了在该转基因植物中生氰糖苷合成的完整途径。基因指的是编码序列和相关调控序列，其中编码序列转录为RNA，例如mRNA、rRNA、tRNA、snRNA、双链RNA、有义RNA或者反义RNA。调控序列的例子是启动子序列、5’和3’非翻译序列和终止序列。还存在其它元件例如内含子。表达通常指的是内源性基因或者转移基因在植物中的转录和翻译。然而，联系到不编码蛋白质的基因例如反义构建体，术语表达仅指转录。本专利技术提供了下述解决方案●编码将氰醇(例如苯乙醇腈、对-羟基苯乙醇腈、丙酮氰醇或2-羟基-2甲基丁腈)；萜类化合物(例如香叶醇、橙花醇或β-香茅醇)；苯基衍生物(例如对-羟基苯甲酸、苯甲酸、苯甲醇、对-羟基苯甲醇、2-羟基-3甲基氧苯甲醇、香草酸或香兰素)或者己醇衍生物(例如1-己醇、反式-2-己烯-1-醇、顺式-3-己烯-1-醇、3-甲基-3-己烯-1-醇、3-甲基-2-己烯-1-醇)偶联到葡萄糖的UDP-葡萄糖-葡萄糖糖苷配基-葡糖基转移酶的DNA分子，以及其编码的蛋白质；●所述编码葡糖基转移酶的DNA分子具有分子式R1-R2-R3，其中--R1、R2和R3是组成序列，包括独立地选自Gly、Ala、Val、Leu、Ile、Phe、Pro、Ser、Thr、Cys、Met、Trp、Tyr、Asn、Gln、Asp、Glu、Lys、Arg、和His氨基酸残基的氨基酸残基，并且--R2包括150或更多氨基酸残基，如使用可选参数设为默认值的计算机程序相似性查询程序BLAST 2.0组中的blastp确定，其序列与SEQID NO1中比对的组成序列至少50％相同。●所述DNA分子，其中R2编码150-425氨基酸残基，例如SEQ IDNO1中21-445、168-448、或者281-448的氨基酸；●所述DNA分子，其中R1和R3独立地包括0-500氨基酸残基；●所述DNA分子，其中R1或者R3编码一种或多种其它的组成序列，所述序列长度至少为30个氨基酸并且与SEQ ID NO1中比对的组成序列(例如SEQ ID NO1中21-55、142-174、或者303-343的氨基酸)至少65％一致，；●所述DNA分子，其编码如SEQ ID NO2所定义的300-600氨基酸残基长的蛋白质，或者是SEQ ID NO1所定义的蛋白质；●分离该cDNA分子的一种方法；●产生纯化的重组UDP-葡萄糖糖苷配基-葡糖基转移酶的方法，其中所述酶将氰醇、萜类化合物、苯基或生物者己醇衍生物偶联到葡萄糖；●一种获得转基因植物的方法以及转基因植物自身，其包括已稳定整合进其基因组的编码该蛋白的DNA，或者编码有义RNA、反义RNA、双链RNA或核酶的DNA，其表达降低所述蛋白的表达。从当前拟南芥(Arabidopsis thaliana)基因组测序计划状态推断，预期拟南芥基因组含有大约120个编码涉及天然产物合成的编码葡糖基转移酶的基因。还预期其它植物也含有许多编码葡糖基转移酶的基因。尽管双色高粱中存在许多葡糖基转移酶，除一个外都对苯乙醇腈和对-羟基苯乙醇腈没有高特异性。该葡糖基转移酶几种同工型的存在有可能考虑到高粱和多倍体形式的进化和分类学背景。对-羟基苯乙醇腈的不稳定以及在柱层析中缺乏含有双色高粱中的对-羟基苯乙醇腈葡糖基转移酶活性的多个峰表明，在生氰糖苷蜀黍氰苷的生物合成中涉及一种特异的葡糖基转移酶(sbHMNGT)。按照通常途径，亦即进行生氰糖苷的生物合成涉及所有植物中同一类型中间体。因此，预期不同种属植物中催化这些过程的酶表现显著的相似性。这一点已在涉及氨基酸转化为肟的部分途径中清楚证明。已证实在所有检验的植物中该部分被一个或多个属于CYP79家族的细胞色素P450酶催化。这些细胞色素P450在氨基酸水平上显示大于40％的序列相同性。芥子油苷合成中氨基酸起始转化为肟也被属于CYP79家族的细胞色素P450酶催化。与以前的这些发现相符，预期植物中合成偶联葡萄糖到氰醇的生氰糖苷遵循保守的涉及结构相关葡糖基转移酶的生化途径。本专利技术的目的是提供编码UDP-葡萄糖糖苷配基-葡糖基转移酶的DNA分子，所述酶将许多氰醇、萜类化合物、苯基衍生物和己醇衍生物(对-羟基苯甲酸、苯甲酸、苯甲醇、对-羟基苯甲醇和香叶醇)偶联到葡萄糖，并基于双色高粱UDP-葡萄糖羟基苯乙醇腈-O-葡糖基转移酶的氨基酸序列和其对应基因序列确定其在生氰植物中一般结构。因此本专利技术提供编码UDP-葡萄糖糖苷配基-葡糖基转移酶的DNA分子，所述酶将氰醇(例如苯乙醇腈、对-羟基苯乙醇腈、丙酮氰醇或2-羟基-2甲基丁腈)、萜类化合物(例如香叶醇、橙花醇或β-香茅醇)、苯基衍生物(例如对羟基苯甲酸、苯甲酸、苯甲醇、对-羟基苯甲醇、2-羟基-3甲氧基苯甲醇、香草酸或香兰素)或者己醇衍生物(例如1-己醇、反式-2-己烯-1-醇、顺式-3-己烯-1-醇、3-甲基-3-己烯-1-醇、3-甲基-2-己烯-1-醇)偶联到葡萄糖，其分子式为R1-R2-R3，其中--R1、R2和R3是组成序列，包括独立地选自Gly、Ala、Val、Leu、Ile、Phe、Pro、Ser、Thr、Cys、Me、Trp、Tyr、Asn、Gln、Asp、Glu、Lys、Arg、His氨基酸残基的氨基酸残基，和任选地任何活细胞中翻译后修饰产生的其它氨基酸残基，并且--R2包括150，优选250或更多的氨基酸残基，其序列至少50％，优选至少55％或者甚至更优选至少70％与S本文档来自技高网...

【技术保护点】
编码将氰醇、萜类化合物、苯基衍生物或者己醇衍生物偶联到葡萄糖的ＵＤＰ－葡萄糖：糖苷配基－葡糖基转移酶的ＤＮＡ分子。

【技术特征摘要】
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【专利技术属性】
技术研发人员：P霍耶，BL穆勒，PR琼斯，
申请(专利权)人：阿德雷德研究创新股份有限公司，皇家兽医和农业大学，
类型：发明
国别省市：AU[澳大利亚]