对蛋渍具有改进洗涤性能的枯草杆菌酶变体制造技术

本发明专利技术涉及枯草杆菌酶变体在从待洗衣物或从硬表面除去蛋渍中的应用，此枯草杆菌酶变体在第９５－１０３位（ＢＡＳＢＰＮ编号）活性位点（ｂ）环区含有至少一个额外氨基酸残基。在用于例如包括自动洗碗组合物等清洁或洗涤剂组合物时，这些枯草杆菌酶变体有用，表现出对蛋渍优异的或改进的洗涤性能。本发明专利技术也涉及新的枯草杆菌酶变体，编码此变体的分离ＤＮＡ序列，表达载体，宿主细胞及生产和利用本发明专利技术变体的方法。本发明专利技术还涉及含有本发明专利技术变体的清洁和洗涤剂组合物。（*该技术在2020年保护过期，可自由使用*）

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及利用枯草杆菌酶(subtilase)变体从待洗衣物或从硬表面除去蛋渍。本专利技术特别涉及利用枯草杆菌酶变体从待洗衣物或从硬表面除去蛋渍，其中此枯草杆菌酶变体在第95-103位(BASBPN编号，见下文)活性位点(b)环区含有至少一个额外氨基酸残基。在用于例如清洁或洗涤剂组合物，如衣服洗涤剂组合物或洗碗组合物，包括自动洗碗组合物时，这些枯草杆菌酶变体有用，表现出对蛋渍优异的或改进的洗涤性能。本专利技术也涉及新的枯草杆菌酶变体，编码此变体的分离的DNA序列，表达载体，宿主细胞及生产和使用本专利技术变体的方法。本专利技术还涉及含有本专利技术变体的清洁剂和洗涤剂组合物。大量增加的商用蛋白酶是天然存在的野生型蛋白酶的蛋白质工程变体，例如，DURAZYM(Novo Nordisk A/S)，RELASE(Novo Nordisk A/s)，MAXAPEM(Gist-Brocades N.V.)，PURAFECT(Genencor International，Inc.)。而且，许多蛋白酶变体在本领域中已有描述。现有技术蛋白酶变体的详细名单已在WO99/27082中列出。然而，尽管已有大量有用蛋白酶变体的描述，但对于许多工业应用，仍需求新的改进蛋白酶或蛋白酶变体。具体地说，由于许多蛋白酶被存在于蛋清中的物质抑制，从例如待洗衣物或硬表面除去蛋渍的问题已经被提出。这类物质的例子包括IV-0型胰蛋白酶抑制剂(卵抑制剂(Ovo-inhibitor))及III-0型胰蛋白酶抑制剂(卵类粘蛋白)。因此，本专利技术的目的是提供不被这类物质抑制或仅在有限程度上被抑制的改进的枯草杆菌酶变体。本专利技术的另外一个目的是提供适于从例如待洗衣物和/或硬表面除去蛋渍的改进的枯草杆菌酶变体。本专利技术的第二个方面涉及枯草杆菌酶变体，此变种选自在活性位点(b)环含有至少一个额外氨基酸残基，相当于在第98和99位之间至少一个额外氨基酸残基的插入，并且还含有至少一个额外的修饰(BASBPN编号)的变体，和在活性位点(b)环含有至少一个额外氨基酸残基，相当于在第99和100位之间至少一个额外氨基酸残基的插入，并且还含有至少一个额外的修饰(BASBPN编号)的变体，其中此变体在本文实施例4中所示的“蛋抑制分析”中检测时具有至少10％的残留活性。本专利技术的第三个方面涉及枯草杆菌酶变体，此变种选自在第98和99位之间含有至少一个额外氨基酸残基的插入并且还在133和143位含有替代的变体，在第99和100位之间含有至少一个额外氨基酸残基的插入并且还在99位含有替代的变体，在第98和99位之间含有至少一个额外氨基酸残基的插入并且还在167、170和194位含有替代的变体，在第99和100位之间含有至少一个额外氨基酸残基的插入并且还在第216和217位之间含有至少一个额外氨基酸残基的插入的变体，在第99和100位之间含有至少一个额外氨基酸残基的插入并且还在第217和218位之间含有至少一个额外氨基酸残基的插入的变体，在第99和100位之间含有至少一个氨基酸残基的插入并且还在第42和43位之间含有至少一个额外氨基酸残基的插入的变体，和在第99和100位之间含有至少一个额外氨基酸残基的插入并且还在第129和130位之间含有至少一个氨基酸残基的插入的变体。本专利技术的第四个方面涉及编码本专利技术枯草杆菌酶变体的分离的DNA序列。本专利技术的第五个方面涉及含有本专利技术的分离DNA序列的表达载体。本专利技术的第六个方面涉及用本专利技术表达载体转化的微生物宿主细胞。本专利技术的第七个方面涉及生产本专利技术枯草杆菌酶变体的方法，其中在有益于所述变体表达和分泌的条件下培养根据本专利技术的宿主，并且回收变体。本专利技术的第八个方面涉及含有本专利技术变体的清洁剂或洗涤剂组合物，优选洗衣或洗碗组合物。本专利技术的第九个方面涉及从待洗衣物或从硬表面除去蛋渍的方法，此方法包括将含蛋渍的硬表面或含蛋渍的衣物与含枯草杆菌酶变体的清洁剂或洗涤剂组合物、优选洗衣或洗碗组合物接触，该变体在第95-103位(BASBPN编号)活性位点(b)环区包含至少一个额外氨基酸残基。本专利技术的另外的方面将从下面的描述及从附加的权利要求书中得到体现。关于比对和编号，参考附图说明图1，该图显示了枯草杆菌蛋白酶BPN’(BASBPN)(a)和枯草杆菌蛋白酶309(BLSAVI)(b)之间的比对。在本专利申请中这些比对被用作残基编号的参考。定义在更为详细地论述本专利技术之前，将首先定义下面的术语和约定。变体名称的命名原则和约定在描述根据本专利技术产生或设想的各种枯草杆菌酶变体时，为了便于提及，采用下述命名原则和约定首先通过分离的或亲本酶与枯草杆菌蛋白酶BPN’(BASBPN)之间的比对，定义参照框架。为了给变体编号，可以通过9.1版本GCG软件包的GAP程序利用下述参数获得该比对断缺区产生罚分(gap creation penalty)＝8和断缺区延伸罚分(gap extension penalty)＝8，而所有其它参数保留其默认值。另一种方法是利用枯草杆菌酶之间的已知公认比对，例如描述于WO91/00345中的比对。在大多数情况下，这些差异并不是重要的。因而，可以参照BASBPN对许多缺失和插入进行定义。在图1中，与BASBPN相比，枯草杆菌蛋白酶309(Savinase)在第36、58、158、162、163以及164位具有6个缺失。这些缺失在图1中通过星号(*)标明。在亲本酶中进行的各种修饰通常使用下面三个要素来表示原始氨基酸位置替代氨基酸因此符号G195E是指第195位的甘氨酸被谷氨酸所替代。在原始氨基酸残基可以是任意氨基酸残基的情况下，有时可以使用仅指示位置和替代氨基酸的简写符号位置替代氨基酸关于同源枯草杆菌酶中的修饰，此种符号尤其恰当(见下文)。同样，当替代氨基酸残基的身份不重要时也可以使用原始氨基酸位置当原始氨基酸和替代氨基酸均可以包含任意氨基酸时，则仅指明位置，例如170。当原始氨基酸和/或替代氨基酸可以包含一种以上但又并非所有氨基酸时，则在括号中指出选择的氨基酸原始氨基酸位置{替代氨基酸1，….，替代的氨基酸n}对于具体变体，使用具体的三字母或一字母代码，包括指示任意氨基酸残基的代码Xaa和X。替代谷氨酸在第195位替代甘氨酸命名为 Gly195Glu或G195E或任意氨基酸在第195位替代甘氨酸命名为Gly195Xaa或G195X或Gly195或G195因此，丝氨酸在第170位替代任意氨基酸残基将命名为Xaa170Ser或X170S.或170Ser或170S关于同源枯草杆菌酶中的改变，该符号尤其适合(见下文)。因此170Ser意味着包含例如BASBPN中的Lys170Ser改变和BLSAVI中的Arg170Ser改变(参见图1)。对于原始氨基酸和/或替代氨基酸可以包含一种以上但又并非所有氨基酸的改变，甘氨酸、丙氨酸、丝氨酸或苏氨酸在第170位替代精氨酸可以通过Arg170{Gly，Ala，Ser，Thr}或R170{G，A，S，T}来表示，以指示变体R170G，R170A，R170S，和R170T.缺失第195位甘氨酸的缺失将表示为Gly195*或G195*相应地，一个以上氨基酸残基的缺失，例如第195位甘氨酸和196位亮氨酸缺失将表示为Gly本文档来自技高网...

【技术保护点】
枯草杆菌酶变体在从待洗衣物或从硬表面除去蛋渍中的应用，此枯草杆菌酶变体在第９５－１０３位（ＢＡＳＢＰＮ编号）活性位点（ｂ）环区含有至少一个额外氨基酸残基。

【技术特征摘要】
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【专利技术属性】
技术研发人员：TS法诺，FF迈克尔森，
申请(专利权)人：诺沃奇梅兹有限公司，
类型：发明
国别省市：DK[丹麦]