用于生产胰岛素前体和胰岛素前体类似物的方法技术

具有包含至少一个芳香族氨基酸残基的微型Ｃ肽的新型胰岛素前体和胰岛素前体类似物具有增强的折叠稳定性。该新型胰岛素前体和胰岛素前体类似物可以在酵母中以高产量表达，而且长度优选不超过１５个氨基酸残基。还提供了编码所要求保护的前体或前体类似物的多核苷酸序列，以及包含这些多核苷酸序列的载体和细胞系。（*该技术在2020年保护过期，可自由使用*）

【技术实现步骤摘要】
背景酵母生物体生成许多在细胞外有功能的蛋白质。这些蛋白质称为分泌蛋白。这些分泌蛋白最初以前体的形式表达于细胞内，该前体包含有效指导(运输)表达产物穿过内质网(ER)膜的前肽序列(pre-peptide sequence)。前肽(通常称为信号肽)一般在运输过程中由期望产物切除。一旦进入分泌途径，蛋白质首先被运输至高尔基体。然后，蛋白质可以遵循通向各种区室(诸如细胞液泡或细胞膜)的不同路径，或者运出细胞而分泌到外部培养基中(Pfeffer等人，Ann.Rev.Biochem.，56829-852，1987)。胰岛素是由胰腺β细胞分泌的多肽激素，它由两条多肽链A和B组成，这两条多肽链是通过两个链间二硫键相连的。另外，A链的特点是还具有一个链内二硫键。该激素是以单链前体胰岛素原(前胰岛素原)的形式合成的，它是由24个氨基酸的前肽及随后86个氨基酸的胰岛素原组成的，构型如下前肽-B-Arg Arg-C-Lys Arg-A，其中C是31个氨基酸的连接肽。Arg-Arg和Lys-Arg是由A和B链切除连接肽的切割位点。目前主要使用3种方法在微生物中生产人胰岛素。其中两种方法涉及大肠杆菌，或是在胞质中表达大型融合蛋白(Frank等人，在Rich和Gross编的《PeptidesProceedings of the 7thAmerican PeptideChemistry Symposium》(肽第7届美国肽化学讨论会记录)中，PierceChemical公司，Rockford，IL，第729-739页，1981)，或是使用信号肽从而分泌到周质间隙(Chan等人，PNAS，785401-5404，1981)。第三种方法利用酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)将胰岛素前体分泌到培养基中(Thim等人，PNAS，836766-6770，1986)。现有技术公开了在大肠杆菌(E.coli)或酿酒酵母中表达的有限数目的胰岛素前体，参阅US 5,962,267、WO 95/16708、EP 0055945、EP 0163529、EP 0347845、和EP 0741188。使用圆二色性(CD)来测定蛋白质稳定性和分子的相对稳定性。低于240nm观察到的CD来自肽酰胺发色团，可以用于评估蛋白质二级结构(Johnson，Ann.Rev.Biophys.Chem.，17145-166，1988)。胰岛素光谱的特征是最低位于220和209nm，由负转正的交换接近203nm，最高位于195nm。变性后，240-218nm范围内的负CD逐渐减小，这与伴随蛋白质解折叠的有序二级结构丧失是一致的。因此，可以通过测量二级结构的丧失(作为所加入变性剂如盐酸胍(GuHCl)的函数)而将胰岛素前体的折叠稳定性量化(参阅例如Pace，CRC Crit.Rev.Biochem.，31-43，1975)。专利技术概述本专利技术的特点是新型连接肽(C肽)，在转化微生物(特别是酵母)中表达时，它们赋予胰岛素前体分子和胰岛素前体类似物分子以提高的产量和/或提高的稳定性。然后，可以通过一个或多个合适的、众所周知的转变步骤将这些胰岛素前体或胰岛素前体类似物转变成胰岛素或胰岛素类似物。本专利技术的连接肽包含至少一个芳香族氨基酸残基Phe、Trp、或Tyr，而且通常短于天然人C肽，后者(包括侧翼双碱性切割位点)由35个氨基酸组成。因此，新型连接肽的长度通常不超过15个氨基酸残基，优选不超过9个氨基酸残基。通常，新型连接肽的长度可多达7个或可多达5个氨基酸残基，优选不超过4个氨基酸残基。在天然人胰岛素分子中，连接肽在其C和N端包含切割位点，从而能够在体外由A和B肽切除连接肽。这些切割位点可以是本领域知道的任何方便的切割位点，如可以由溴化氰切割的Met；可以由胰蛋白酶或胰蛋白酶样蛋白酶切割的单个碱性氨基酸残基或一对碱性氨基酸残基(Lys或Arg)；水解无色杆菌(Achromobacter lyticus)蛋白酶或羧肽酶蛋白酶的切割位点。能够由A链切除连接肽的切割位点优选单个碱性氨基酸残基Lys或Arg，优选Lys。或者，可以切割B链中的天然LysB29氨基酸残基，产生desB30胰岛素前体或desB30胰岛素前体类似物，由此由B链切除连接肽。然后可以通过众所周知的体外酶促流程添加期望的B30氨基酸残基。在一个实施方案中，连接肽不包含两个相连碱性氨基酸残基(Lys、Arg)。在这个实施方案中，可以在位于A链N端的单个Lys或Arg和位于B链B29的天然Lys实现由A链切除连接肽。连接肽可以包含超过一个芳香族氨基酸残基，但是优选不超过5个。芳香族氨基酸残基可以是相同的或不同的。连接肽优选不包含超过3个芳香族氨基酸残基，最优选只包含一个芳香族氨基酸残基。在本专利技术的一个实施方案中，连接肽中的芳香族氨基酸残基之一紧挨与A链相邻的切割位点的N端。另外，优选芳香族氨基酸残基之一与B链中B11、B12、或B26的至少一个残基的距离小于5。在一个实施方案中，紧挨与A链相邻的切割位点N端的芳香族氨基酸与B链中B11、B12或B26的至少一个残基距离少于5。胰岛素前体或胰岛素前体类似物的特征是在溶液中具有高折叠稳定性。依照本专利技术的前体所具有的Cmid稳定性相比于在连接肽中不包含芳香族氨基酸残基的胰岛素或胰岛素类似物得到了提高。Cmid稳定性因而高于大约5.5M GuHCl，通常高于大约6.0M GuHCl，更通常高于大约6.5M GuHCl。因此，在一个方面，本专利技术涉及包含可以由A和B链切除的连接肽(C肽)的胰岛素前体或胰岛素前体类似物，所述连接肽包含至少一个芳香族氨基酸残基和得以切割A链与连接肽之间的肽键的切割位点，且其中一个芳香族氨基酸残基紧挨所述切割位点的N端。在另一方面，本专利技术涉及包含可以由A和B链切除的连接肽(C肽)的胰岛素前体或胰岛素前体类似物，所述连接肽可由多达9个氨基酸残基组成，且其中至少一个是芳香族氨基酸残基。在还有一个方面，本专利技术涉及包含可以由A和B链切除的连接肽(C肽)的胰岛素前体或胰岛素前体类似物，所述连接肽包含与位于B链中B11、B12、或B26的至少一个残基的距离小于5的一个芳香族氨基酸残基。在还有一个方面，本专利技术涉及包含可以由A和B链切除的连接肽(C肽)的胰岛素前体或胰岛素前体类似物，所述连接肽包含至少一个芳香族氨基酸残基。所述胰岛素前体或胰岛素前体类似物所具有的Cmid稳定性相对于在连接肽中不包含芳香族氨基酸残基的胰岛素前体或胰岛素前体类似物得到了提高。提高的稳定性可通过本领域技术人员知道的多种方法测定，该方法描述于下文。在一个实施方案中，提高的稳定性是通过CD测定实现胰岛素前体分子最大解折叠半值所需要的盐酸胍(GuHCl)浓度(Cmid)来测量的。在另一方面，本专利技术涉及包含如下通式的胰岛素前体或胰岛素前体类似物B(1-27)-X2-X3-X1-Y-A(1-21)其中X1是1-15个氨基酸残基的肽序列，且包含紧挨Y N端的一个芳香族氨基酸残基；X2是位于B链第28位的Pro、Asp、Lys、或Ile之一；X3是位于B链第29位的Pro、Lys、Ala、Arg、或Pro-Thr之一；Y是Lys或Arg。在一个实施方案中，X1的长度是1本文档来自技高网...

【技术保护点】
包含可以由Ａ和Ｂ链切除的连接肽（Ｃ肽）的胰岛素前体或胰岛素前体类似物，所述连接肽包含至少一个芳香族氨基酸残基和得以切割Ａ链与连接肽之间的肽键的切割位点，其中一个芳香族氨基酸残基紧挨所述切割位点的Ｎ端。

【技术特征摘要】
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【专利技术属性】
技术研发人员：TB杰尔狄森，S鲁德维森，NC卡舒尔姆，
申请(专利权)人：诺沃挪第克公司，
类型：发明
国别省市：DK[丹麦]