粘粒DNA构建体以及制备和使用该构建体的方法技术

本发明专利技术公开了个体中诱导抗病原体的免疫应答的方法。本发明专利技术公开了治疗易患或患有与遗传缺陷相关疾病的个体的方法，所述遗传缺陷导致蛋白的不生成或生成不足或生成非功能性或部分功能性蛋白。本发明专利技术公开了将蛋白传递给个体的方法。本发明专利技术还公开了包含粘粒的药物组合物。（*该技术在2020年保护过期，可自由使用*）

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及组合物以及将遗传物质引入个体细胞中的方法。本专利技术的组合物和方法能用于传递含有遗传物质的保护剂和/或治疗剂，该遗传物质编码用于预防和/或治疗性免疫的蛋白靶以及非免疫原性治疗蛋白。本专利技术涉及包含可表达形式的核苷酸序列的DNA粘粒，该核苷酸序列编码免疫原性蛋白或非免疫原性治疗蛋白，本专利技术还涉及包括相同粘粒的药物组合物，涉及个体中诱导抗免疫原的免疫应答的方法，还涉及通过提供治疗性蛋白预防和/或治疗性地处置个体的方法。在设计这些疫苗时认识到，在接种了疫苗的个体中产生靶抗原的疫苗可有效诱导免疫系统的细胞臂。具体而言，减毒的活疫苗、使用无毒载体的重组疫苗和DNA疫苗均导致抗原在接种了疫苗的个体的细胞中产生，由此诱导免疫系统的细胞臂。另一方面，只包括蛋白和诱导体液应答的死疫苗或灭活疫苗的亚单位疫苗，不诱导良好的细胞免疫应答。对于提供抗病原体感染保护，和提供有效用于治疗病原体感染、癌症或自身免疫病的免疫介导疗法，细胞免疫应答常常是必须的。因此，在接种了疫苗的个体中产生靶抗原的疫苗是优选的，例如减毒的活疫苗、使用无毒载体的重组疫苗和DNA疫苗。尽管这些疫苗对于预防性或治疗性地使个体免患病原体感染或人类疾病常常是有效的，但改良的疫苗仍是需要的。产生增强的免疫应答的组合物和方法也是需要的。除了预防和治疗性免疫外，免疫应答可作为一种获得组合物例如包括针对特定免疫原的抗体的抗体组合物的方法而被诱导。基因治疗与免疫不同，采用编码非免疫原性蛋白的核酸分子。这种核酸分子的表达在给予其的个体中有良好的疗效。一种具体类型的基因治疗涉及将编码调控个体免疫应答的非免疫原性蛋白的基因给予个体，发挥疗效。例如，可以设计将对与自身免疫病相关的免疫应答有负调节作用的非免疫原性蛋白的基因导入个体以获得疗效。因此，用于调节免疫应答的基因治疗组合物及其制备和使用方法是需要的。也可以考虑用其他方式调节免疫应答，治疗诸如自身免疫病和细胞、组织、器官的移植物排斥反应。对于可用于调节免疫应答的组合物及方法，以及用于设计和发现这种用于调节免疫应答的组合物的组合物和方法是需要的。将正常功能基因直接引入到活动物中已作为一种办法用于代替有缺陷的遗传信息来进行研究。一些研究将DNA直接引入到活动物的细胞中而不采用病毒颗粒或其它感染载体。Nabel，E.G.等(1990)Science 2491285-1288公开了直接转入小鼠动脉壁的β-半乳糖苷酶基因的体内位点特异的基因表达。Wolfe，J.A.等(1990)Science2471465-1468公开了许多直接转入小鼠肌肉的报道基因的体内表达。Acsadi G.等(1991)Nature 352815-818公开了肌内注射DNA构建体后小鼠中人肌营养不良蛋白基因的表达。在此引入本文的Wolfe，J.A.等1991 BioTechniques 11(4)474-485提及影响基因直接转入啮齿类动物肌肉体内的条件。Felgner，P.L.和G.Rhodes(1991)Nature349351-352公开了体内直接传递作为药物的纯化基因而不采用反转录病毒。在保护和治疗性的免疫方案以及非免疫原性治疗中直接注射DNA描述在美国专利5,593,972，5,589,466，5,830,876，5,817,637，5,98 1,505，5,739,118，5,962,428，5,837,533，PCT/US90/01515，PCT/US93/02338，PCT/US93/048131以及PCT/US94/00899中，分别在此引作参考。除了上述申请所描述的传递方案外，另一些传递DNA的方法描述在美国专利4,945,050和5,036,006中，两者在此引作参考。实质上，将基因构建体直接传递到无感染剂如复制或非复制病毒颗粒的个体中。需要更有效的诱导免疫应答和传递治疗蛋白的组合物和方法。本专利技术涉及治疗易患或正患有与遗传缺陷相关疾病的个体的方法，所述遗传缺陷导致不生成蛋白或蛋白生成不足或生成非功能性或部分功能性蛋白。这些方法包括给个体提供粘粒的步骤，该粘粒包括编码补偿性蛋白的DNA，所述补偿性蛋白用于补偿蛋白不生成、生成不足、非功能性或部分功能性的蛋白。粘粒包含至少50kb的DNA，包括编码核苷酸序列，该编码核苷酸序列编码补偿性蛋白，其可操作地与所述个体细胞中功能性的调节元件相连接，其中所述粘粒被所述个体的细胞吸收后，表达所述编码核苷酸序列并且生成补偿性蛋白，其量可有效补偿蛋白不生成、生成不足、非功能性或部分功能性蛋白。粘粒可包含80-100或更多kb的DNA。本专利技术涉及将蛋白传递给个体的方法，其包括给个体施用粘粒的步骤，该粘粒包含至少50kb的DNA，包括编码蛋白的编码核苷酸序列。该编码核苷酸序列可操作地与个体的细胞中功能性的调节元件相连接。粘粒被个体中的细胞吸收后，表达编码核苷酸序列并生成蛋白。该粘粒可包含80-100或更多kb的DNA。本专利技术涉及包含粘粒的药物组合物，该粘粒包含至少50kb的DNA，包括编码一个或多个蛋白的编码核苷酸序列，所述一个或多个蛋白包括至少一种免疫原性蛋白，其可与病原体抗原有免疫原性地交叉反应。该编码核苷酸序列可操作连接到调节元件上。该药物组合物可进一步包括DNA疫苗助剂(facilitator)。本专利技术涉及包含粘粒的药物组合物，该粘粒包含至少50kb的DNA，包括编码核苷酸序列，其编码一个或多个蛋白，包括至少一种非免疫原性蛋白。该编码核苷酸序列可操作连接到调节元件上。药物组合物可进一步包括DNA疫苗助剂。图2表示各种采用不完全HSV-1基因组插入所构建的重组粘粒。图3数据显示在预防性施用附图说明图1和2所描述的粘粒后所获得的抗HSV-1感染的保护水平。本专利技术提供引入遗传物质的改进方法，该方法优于依赖质粒作为载体用于基因传递的DNA转移技术。根据本专利技术，提供粘粒而非质粒。粘粒比质粒具有数个优点，包括使用粘粒能被制成的DNA构建体的大小。粘粒一般为50-100kb的DNA，与质粒比较能用来传递更大的DNA构建体。较大DNA构建体能用于提供多编码序列，包括多拷贝的相同编码序列和/或多编码序列。例如单个粘粒能用来传递遗传物质，该遗传物质能诱导抗多种病原体的免疫应答。此外，处理简便和DNA便宜特性使其适用于有效的筛选保护性抗原的方法。基因比蛋白更易被分类和系统性测试。挑选出正生成疫苗来防御的致病剂和生物以及鉴定免疫原性蛋白。本专利技术的优势在于能够在单个载体构建体上包括大部分的DNA。在一些实施方案中，大部分的病原体基因组可包括在粘粒DNA构建体中。如此大的编码区提供了诱导抗多病原体抗原的免疫应答的方法。通过测试部分基因组以鉴定基因构建体就能使保护性抗原的鉴定变得容易，所述基因构建体含有多编码序列，包括编码保护性抗原的序列。然后，亚克隆能用于鉴定涉及诱导保护性应答的特异抗原。在一些实施方案中，本专利技术粘粒包括编码多个蛋白的编码序列。这些构建体能代表单种活性物质，能够传递免疫原性靶和赋予抗来自一种以上病原体的多病原体抗原的免疫性。最新专利技术考虑采用能用于传递多免疫原的单个载体，因而减少了将产生活性物质的数目以及待施用疫苗的数目。在一些实施方案中，本专利技术的粘粒包含编码多蛋白的编码序列。这些构建体能代表本文档来自技高网...

【技术保护点】
在个体中诱导抗病原体的免疫应答的方法，包括将粘粒施用给所述个体的步骤，其中所述粘粒包含至少５０ｋｂ的ＤＮＡ，该ＤＮＡ包括编码一种或多种蛋白的编码核苷酸序列，所述蛋白包括至少一种免疫原性蛋白；所述编码核苷酸序列可操作地与所述个体的细胞 中功能性调节元件连接；所述粘粒被所述个体的细胞吸收后，所述编码核苷酸序列表达并且抗所述免疫原性病原体蛋白的免疫应答在所述个体中受到诱导；所述抗所述免疫原性蛋白的免疫应答可与病原体抗原发生交叉反应。

【技术特征摘要】
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【专利技术属性】
技术研发人员：戴维B韦纳，辛正任，张东辉，
申请(专利权)人：宾夕法尼亚大学理事会，
类型：发明
国别省市：US[美国]