锌指结构域及其鉴定方法技术

本发明专利技术公开了鉴定识别任何给定靶位点的锌指结构域的体内筛选方法。也公开了识别特定位点的锌指结构域的氨基酸序列。（*该技术在2021年保护过期，可自由使用*）

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及DNA-结合蛋白例如转录因子。
技术介绍
大多数基因在转录水平上受与基因中一般是启动子或者增强子区中特异性DNA位点结合的多肽转录因子的调节。这些蛋白质激活或抑制RNA聚合酶在启动子处对转录的起始，从而调节靶基因的表达。很多转录因子，激活剂和抑制剂，结构是模块化的。这样的组件能够折叠为结构上独特的结构域并且具有特异功能，例如DNA结合，二聚化作用，或者与转录机构相互作用。效应子结构域例如激活结构域或抑制结构域当转移到异源转录因子的DNA-结合结构域时保持它们的功能(Brent和Ptashne，(1985)Cell 43729-36；Dawson等，(1995)Mol.Cell Biol.156923-31)。很多三维DNA-结合结构，包括锌指结构域，同源域，和螺旋-转角-螺旋结构域，已经根据NMR和X-射线晶体学数据确定出来。专利技术概述本专利技术提供快捷并且可定量地对嵌合转录因子鉴定和构建的以细胞为基础的方法。这样的转录因子可以用来例如改变生物药物和生物工程应用中内源基因的表达。在体内，即在完整活细胞中测试转录因子。通过例如在基因组序列筛选中应用该方法能够找到的新的核酸结合结构域也在本专利技术范围内。本专利技术特征在于鉴定识别DNA上靶点的肽结构域的方法。该方法有时在这里称″结构域筛选方法″或者″体内筛选方法″。该方法包括提供(1)包含报道基因构建体的细胞和(2)多个杂合核酸。所述报道基因构建体具有与具有募集位点(recruitment site)和靶位点的启动子可操作连接的报道基因。当转录因子识别(即以高于背景的程度结合)启动子的募集位点和靶位点时，报道基因表达高于给定水平，但是当转录因子只识别启动子的募集位点时则不如此。每一个杂合核酸编码具有下面元件的非天然存在的蛋白质(i)转录激活结构域，(ii)识别募集位点的DNA结合结构域，和(iii)试验锌指结构域。试验锌指结构域的氨基酸序列随着该多个杂合核酸中的不同成员而不同。该方法还包括在使至少一个核酸进入至少一个细胞的条件下使该多个核酸接触细胞；在使得杂合核酸在细胞中表达的条件下维持细胞；鉴定高于给定水平表达报道基因的细胞，这是细胞包含编码识别靶位点的试验锌指结构域的杂合核酸的指征。所述DNA结合结构域，即识别募集位点并且不随着多个核酸各成员而不同的结构域，可以包括，例如，一个，两个，三个，或者多个锌指结构域。该方法中使用的细胞可以是原核细胞或者真核细胞。举例的真核细胞是酵母细胞，例如啤酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)，粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomyces pombe)，或者，巴斯德毕赤氏酵母(Pichia pasteuris)；昆虫细胞例如Sf9细胞；和哺乳动物细胞例如成纤维细胞或淋巴细胞。″给定水平″是当转录因子识别募集位点但是不识别靶位点时观察到的表达量。″给定水平″在某些情况下可以是零(至少在应用的测试检测范围内)。所述方法可以包括从核酸例如基因组DNA，mRNA混合物，或者cDNA扩增编码试验锌指结构域的源核酸产生扩增的片段的附加步骤。使用寡核苷酸引物可以扩增源核酸。所述寡核苷酸引物可以是与编码保守结构域边界的核酸退火的一组简并寡核苷酸(例如，具有不同核酸序列的特异性寡核苷酸的集合，或者具有非天然碱基例如肌苷的特异性寡核苷酸的集合)之一。或者，所述引物可以是特异性寡核苷酸。使用扩增的片段产生杂合核酸用于包含在上述方法中使用的多个杂合核酸中。所述方法可以进一步包括步骤(i)在序列数据库中鉴定侯选锌指结构域氨基酸序列；(ii)提供编码候选锌指结构域氨基酸序列的侯选核酸；和(iii)使用侯选核酸构建杂合核酸用于包含在上述方法中使用的多个杂合核酸中。所述数据库包括多个氨基酸序列的记录，例如，已知的和/或预测的蛋白质，以及多个核酸序列，例如cDNAs，ESTs，基因组DNA，或者计算机处理去除预测的内含子的基因组DNA。如果期望，可以重复该方法来鉴定识别第二靶位点的第二试验锌指结构域，所述第二靶位点例如是除了第一试验锌指结构域识别的位点之外的位点。接着可以构建编码第一和第二鉴定的试验锌指结构域的核酸。编码的杂合蛋白特异性识别包括第一试验锌指结构域的靶位点和第二试验锌指结构域的靶位点的靶位点。本专利技术特征还在于确定试验锌指结构域是否识别启动子上的靶位点的方法。该方法在这里有时指″位点筛选方法″。该方法包括提供报道基因构建体和杂合核酸的步骤。报道基因可操作连接包括募集位点和靶位点的启动子，并且当转录因子识别启动子的募集位点和靶位点时高于给定水平表达，但是转录因子只识别启动子的募集位点时则不如此。所述杂合核酸编码具有下面元件的非天然存在的蛋白质(i)转录激活结构域，(ii)识别募集位点的DNA结合结构域，和(iii)试验锌指结构域。该方法还包括在使得报道基因构建体进入细胞的条件下使报道基因构建体接触细胞；在上述步骤之前，之后，或者同时，在使杂合核酸进入细胞的条件下使杂合核酸与细胞接触；在使杂合核酸在细胞中表达的条件下保持细胞；并且检测细胞中报道基因的表达。报道基因表达水平大于给定水平是试验锌指结构域识别靶位点的指征。在不同质粒中可以包含报道基因构建体和杂合核酸。这两个质粒同时或相继插入细胞。一个质粒或两个质粒可以含有合适的可选择标记物。报道基因构建体和杂合核酸也可以包含在相同质粒上，在这种情况下只需要一个步骤将两个核酸导入细胞。在另一个实施方案中，这一个或两个核酸被稳定插入细胞的基因组。对于这种方法，和对于这里描述的任何体内方法一样，可以用转录抑制结构域置换转录激活结构域，并且鉴定其中报道基因表达水平低于给定水平的细胞。本专利技术的另一个方法有利于通过融合两个细胞快速确定试验锌指结构域的结合偏好(binding preference)。该方法包括提供含有报道基因的第一细胞；提供含有杂合核酸的第二细胞；融合第一和第二细胞形成融合细胞；在使杂合核酸在融合细胞中表达的条件下保持融合细胞；并且检测融合细胞中报道基因表达，其中报道基因表达水平大于给定水平是试验锌指结构域识别靶位点的指征。例如，所述第一和第二细胞可以是组织培养细胞或真菌细胞。举例的实施方法使用啤酒酵母(S.cerevisiae)细胞。所述第一细胞具有第一接合类型，例如MATa；所述第二细胞具有与第一细胞不同的第二接合类型，例如MATα。这两个细胞彼此接触，酵母接合产生具有含有第一细胞和第二细胞基因组的细胞核的单细胞(例如MATa/α)。该方法可以包括提供多个第一细胞，都具有相同的第一接合类型，其中各个第一细胞包含具有不同的靶位点的报道基因构建体。也提供多个第二细胞，都具有相同的第二接合类型，并且各自具有不同的试验锌指结构域。多个成对接合产生矩阵，例如所有可能的成对接合。利用该方法来测定多个试验锌指结构域对多个结合位点例如一全套可能的靶位点的结合偏好。本专利技术也提供了测定试验锌指结构域结合偏好的方法。所述方法包括提供(1)细胞，基本上所有的细胞都包含杂合核酸，和(2)多个报道基因构建体。这多个报道基因构建体的每一个具有与具有募集位点和靶位点的启动子可操作连接的报道基因。当转录因子识别启动子的募集位点和靶位点两者时报道基因表达高于给定水平，但是当转录因子只本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种鉴定识别ＤＮＡ上靶位点的锌指结构域的方法，该方法包括：（ａ）提供包含报道构建体的细胞，所述构建体包含与启动子可操作连接的报道基因，其中当转录因子识别启动子的募集位点和靶位点两者时报道基因表达高于给定水平，但是当转录因子识别启动子的募集位点时则不这样；（ｂ）提供多个杂合核酸，其中每一个编码包含（ｉ）转录激活结构域，（ｉｉ）识别募集位点的ＤＮＡ结合结构域，和（ｉｉｉ）试验锌指结构域的非天然存在的蛋白质，其中编码的试验锌指结构域的氨基酸序列在所述多个杂合核酸的成员间各不相同；（ｃ）在使得所述多个杂合核酸中的至少一个进入至少一个细胞的条件下使所述多个杂合核酸接触所述细胞；（ｄ）在使杂合核酸在所述细胞中表达的条件下保持所述细胞；和（ｅ）鉴定含有（ｂ）的杂合核酸并且报道基因表达高于给定水平的细胞，报道基因表达高于给定水平是细胞包含编码识别靶位点的试验锌指结构域的杂合核酸的指征。

【技术特征摘要】
...

【专利技术属性】
技术研发人员：金晋秀，权宁道，金炫元，柳银铉，黄文宣，
申请(专利权)人：图尔金株式会社，
类型：发明
国别省市：KR[韩国]