组织工程全层皮肤的制备方法技术

一种组织工程全层皮肤的制备方法，属于一种可以移植的含活细胞基质的全层人工皮肤制备领域。它包括胶原凝胶的准备、防止胶原凝胶的收缩、全层皮肤的培养和真皮、表皮分离后用胶原酶的消化。通过本发明专利技术制备的全层皮肤在组织学结构和超微结构等方面都比现有人工皮肤更接近于天然皮肤，可以直接应用于多种类型如烧伤、溃疡、创伤、畸形、术后缺损和疤痕等皮肤的修复和愈合。（*该技术在2022年保护过期，可自由使用*）

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】
本专利技术涉及一种用组织工程途径来制备全层皮肤的方法，属于可以移植的含活细胞与细胞基质的全层人工皮肤的制备领域。2001年2月6日伍津津等人申请了有关专利(申请号为01107099.4)，该专利技术包括各种溶液的配制、胶原凝胶的制备和细胞的三维培养。这种人工皮肤弹性和柔韧性尚好，能够被剪切，但尚存在一些缺陷1、虽然具有较成熟的表皮层和真皮层，但体外培养时间过长，总共需大约20天，延长了病人等待手术的时间；2、未说明该专利技术制备人工皮肤中是否有基底膜，组织学观赏结果中未提及是否有角朊细胞之间最重要的连接方式——桥粒的出现，未说明所培养的复合人工皮肤具有和天然皮肤相似的超微结构，因此会影响人工皮肤的强度与应用效果；3、未明确人工皮肤中细胞的来源；4、该专利技术制备的人工皮肤中仍残留有大量的有孔胶状基质，这将影响细胞的生长、细胞之间的相互作用，该人工皮肤移植后容易引起感染。另外一个与本专利技术有关的现有技术专利文献——2001年2月28日公告的马克-艾森泊格(奥特克国际公司)申请的专利(专利号91109937.9)，该专利技术是在多孔的、交联化的胶原海绵膜的一面上接种上成纤维细胞，培养该成纤维细胞使其遍布生长在胶原海绵膜上；在多孔胶原的另一面形成一层无孔胶原，然后在此面接种培养的角化细胞。但是，1、该专利技术未建立三维培养环境，成纤细胞不能长入该专利技术所用的胶原海绵膜中，而只是在其表面生长，因而，并未形成真正的真皮组织；2、该专利技术在多孔胶原的另一面(无细胞的无孔胶原面)上接种培养角化细胞，不能使生长的角化细胞与真皮层中的成纤维细胞发生相互的关系，因而无法形成皮肤中重要的基底膜结构，使得表皮层与真皮层极易剥离，影响移植修复效果；3、该专利技术未使用器官培养方法(即使用气液面培养方法和特定的培养液)，未使得角化细胞(即角朊细胞或表皮细胞)复层化(表皮的成熟过程)，因而所获得的表皮层是一种单层膜状结构，不符合真正的表皮结构，不可能形成表皮层应有的基底层、棘细胞层、颗粒层和角化层。本专利技术的内容本专利技术要解决的技术问题是为了克服
技术介绍
中所述的不足，而提供一种收缩率低、培养时间短、不发生明显免疫排斥、与天然皮肤结构更相似的。实现本专利技术的技术解决方案准备胶原溶液在无菌条件下将复合胶原溶于0.1％醋酸中，再用紫外线照射胶原溶液；防止胶原凝胶收缩将无菌尼龙膜置入培养板孔中，用1.1所述的复合胶原溶液浸湿放孵箱中使其固化，再把尼龙膜浸入含戊二醛的磷酸钠盐缓冲液(PBS，下同)内放置，用该溶液冲洗和用成纤维细胞培养液冲洗，之后置于最低必须培养液(DMEM，下同)中进行培养；细胞的三维培养将无菌尼龙膜置入培养皿内滴加胶原溶液固化，再把尼龙膜浸入含1％戊二醛的PBS中，得后用培养液冲洗，然后置于成纤维细胞培养液中静置；再将尼龙膜放在培养皿中，准备胶原溶液，用紫外线照射后加入DMEM和胎牛血清(FBS，下同)用NaOH中和混合，加入成纤维细胞悬液后放入孵箱内固化，然后加入成纤维细胞培养液培养；真皮、表皮分离后用胶原酶消化真皮组织。本专利技术所产生的积极效果是按本专利技术所制备的组织工程全层皮肤，除了具有一定的弹性、韧性，能抵抗一定的摩擦力外，最重要的是该专利技术还具有收缩率低、培养时间短、不发生明显免疫排斥反应、与天然皮肤的结构更相似等特点。胶原凝胶为成纤维细胞向三维方向的生长提供了一个支架材料，并且使得所形成的真皮组织具有一定的厚度，满足了日后临床应用上的需要。此外，胶原凝胶中的成纤维细胞和胶原凝胶表面的角朊细胞可以直接接触，加快和促进两种细胞的成熟过程，缩短了整个组织工作全层皮肤的培养时间。但在培养的过程中，胶原凝胶很容易发生收缩。而本专利技术采用的尼龙膜预处理法，大大减少了胶原凝胶收缩的程度，形成的组织工程全层皮肤更利于临床上的手术操作。本专利技术的角朊细胞和成纤维细胞来源十分广泛，可以预先培养出临床上所需的不同大小的组织工程全层皮肤，随时满足不同患者的需要，患者无需等待组织工程全层皮肤的培养过程，因此可以大大缩短患者的住院时间。对组织工程全层皮肤的形态和超微结构观察结果表明，培养的生物活性皮肤替代物的结构和天然皮肤有着高度一致的两层结构表皮层和真皮层。表皮层中含有基底层、棘层、颗粒层和角质层。棘层细胞之间存在细胞间桥，表皮层和真皮层之间有完整的基底膜，并有连续的、长度不等的上皮钉突的出现。该皮肤组织中已无培养时加入的胶原残留物。透射电镜观察结果中，生物活性皮肤的表皮层中，棘层细胞之间以桥粒连接，并具有天然皮肤中所具有的板层体、张力纤维和脂滴等超微结构。这些结构的存在可以抵抗一定程序的外界摩擦，使表皮和真皮间的结合更加紧密，对于其发挥类似天然皮肤的各种功能是十分必要的，而且还有利于手术上的操作。由本专利技术制备的全层皮肤进行了同种异体大鼠间(SD大鼠与Wistar大鼠之间)的动物移植试验，结果表明，移植后的组织工程全层皮肤生长愈合良好，愈合后的组织工程全层皮肤与周围的天然皮肤无明显界限，表皮层和真皮层的结构更加紧密，表皮层的角化更明显，上皮钉突明显增多、伸长，真皮层中无明显的炎细胞浸润，真皮层中有大量的新生血管长入，胶原的结构变得规则、粗大。具体实施例方式本专利技术所述组织工程全层皮肤的制备可通过以下实例来说明。实施例11、1岁至30岁男性包皮切除术后皮肤组织，用1％含青/链霉素的0.1M磷酸钠盐缓冲液(MPBS，下同)冲洗，修剪多余的脂肪和肌肉组织。将皮肤组织条放入无菌管中，并加中性蛋白酶(Dispase，下同)4U/ml，在37℃、90min的条件下消化后分离表皮和真皮。2、角朊细胞的获得将获得的上皮组织用胰酶(0.25％)/EDTA(0.02-0.1％)(2∶1)，37℃，消化8分钟，100目或200目滤网过滤，将收获的角朊细胞接种入培养瓶，扩大培养。3、成纤维细胞的获得用625U/ml胶原酶消化真皮组织，37℃消化120min后，100或200目滤网过滤，将收获的成纤维细胞接入培养瓶，扩大培养。4、准备胶原溶液在无菌条件下，将胶原溶于0.1％醋酸中，浓度为10mg/ml，此过程需2天前准备，在4℃条件下以防止胶原溶液降解。使用前将所需的胶原溶液注入培养皿中，置于冰上，紫外灯下照射30min。5、防止胶原凝胶收缩的方法将无菌尼龙膜置入培养皿中并与底部密合，膜上滴加胶原溶液，浸湿尼龙膜后，去除多余的胶原溶液。37℃固化30min。将尼龙膜浸入含1％戊二醛的PBS中，4℃放置1h。用PBS洗4次，用成纤维细胞培养液洗2次，每次至少20min，之后置于4℃新鲜的成纤维细胞培养液中8-15h。6、组织工程全层皮肤的三维培养①、将尼龙膜放在培养孔(或培养皿)的底部，准备胶原溶液，加入1/10体积的10×DMEM、FBS(胎牛血清)，用1M的NaOH调节PH值至7.2-7.4，加入纤维细胞悬液，充分混合(避免气泡)。将培养板放入孵箱中固化约30min，然后加入成纤维细胞培养液，培养3天。②、收集角朊细胞，以3×106/ml的浓度植入含有成纤维细胞的胶原凝胶表面，静置1.5-2h，加表皮细胞培养液，培养2天。③、当上皮细胞生长良好时，将带有尼龙膜的胶原凝胶取出放在不锈钢网格上，将不锈钢网格放入较大的培养皿中。3-4天后，去除尼龙膜，即为培养成功的组织工程全层皮肤，期间每天本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种组织工程全层皮肤的制备方法，包括将原料的表皮和真皮分离、细胞的三维培养，其特征是：１．１准备胶原溶液：在无菌条件下将复合胶原溶于０．１％的醋酸中，再用紫外线照射胶原溶液；１．２防止胶原凝胶收缩：将无菌尼龙膜置入培养板孔中，用１． １所述的复合胶原溶液浸湿放孵箱中使其固化，再把尼龙膜浸入含戊二醛的磷酸钠盐缓冲液（ＰＢＳ，下同）内放置，并用该溶液冲洗和用成纤维细胞培养液冲洗，之后置于最低必须培养液（ＤＭＥＭ，下同）中进行培养；１．３细胞的三维培养：将无菌尼龙膜置入培 养皿内滴加胶原溶液固化，再把尼龙膜浸入含１％戊二醛的ＰＢＳ中，待后用成纤维细胞培养液冲洗，然后置于成纤维细胞培养液中静置；再将尼龙膜放在培养皿中，准备胶原溶液，用紫外线照射后加入ＤＭＥＭ和胎牛血清（ＦＢＳ，下同）用ＮａＯＨ中和混合，加入成纤维细胞悬液后放入孵箱内固化，然后加入成纤维细胞培养液培养；１．４真皮、表皮分离后用胶原酶消化真皮组织。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】

【专利技术属性】
技术研发人员：金岩，刘源，吕红兵，赵宇，聂鑫，
申请(专利权)人：中国人民解放军第四军医大学口腔医学院，
类型：发明
国别省市：87[中国|西安]