海藻中提取铁超氧化物歧化酶的方法技术

本发明专利技术公开了从海藻中提取铁超氧化物歧化酶（Ｆｅ－ＳＯＤ）的方法。由于该方法是从天然材料中提取铁超氧化物歧化酶，海藻原料充足，不存在紧缺现象，同时材料成本相对于提取产品来说也是十分低廉。得到的产品比活相当高，活力损失相对较小，可以满足一般的医药需求，并且符合当代人“崇尚自然，回归自然”的心理需求，不存在转基因生产导致的基因污染问题。工艺中采用了ＤＥＡＥ－Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ　Ｆａｓｔ　Ｆｌｏｗ和ＣＭ－Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ　Ｆａｓｔ　Ｆｌｏｗ两种层析材料，其特点是流速快、可大量分离样品，同时可反复再生利用，能实现大规模工业化生产。（*该技术在2022年保护过期，可自由使用*）

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及从。
技术介绍
超氧化物歧化酶(Superoxide dismutase，简称SOD)是一类广泛存在于生物体内的金属酶。目前人们按金属辅基的不同已发现了四种SOD，分别是Cu/Zn-SOD、Mn-SOD、Fe-SOD和Ni-SOD。由于SOD能清除生物氧化产生的氧自由基而起保护细胞的作用，对氧自由基引起的许多疾病都有较好的疗效，并可减慢机体衰老，所以将SOD开发应用为药物具有积极的意义。大量实验证明，SOD具有防止脂质过氧化、抗衰老、治疗冠心病、再灌流损伤(器官移植等)、关节炎、自身免疫、放射病及化疗引起的骨髓损伤等疾病的作用。它作为一类新型的治疗酶制剂和化妆品新原料在临床治疗及机体保护方面都有着重要的意义。含铁超氧化物歧化酶(Fe-SOD)呈黄褐色，主要存在于原核细胞和真核细胞的基质中。海藻(例如螺旋藻)中的铁超氧化物歧化酶不仅含量较高，而且海藻的来源丰富，是Fe-SOD的大规模生产的好材料。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供从。，包括以下步骤1)取新鲜海藻以1∶2～3的重量体积比加入pH值7～8、浓度为50～l00mmol/L、含0.5mmol/L EDTA的磷酸缓冲液，将混和液进行超声破碎，破碎液离心，取上清；2)将上清在50℃～55℃水浴中不断搅拌，进行热变性处理，去杂蛋白；3)离心步骤2)所得上清液，加入(NH4)2SO4至饱和浓度40～50％，静置数小时，再离心、取上清，在上清液中加(NH4)2SO4至饱和浓度85％，静置数小时，离心、取沉淀；4)取步骤3)所得沉淀，用pH值7～8的磷酸缓冲液溶解，上Sephadex G-25脱盐柱，用自动收集器收集酶活性部分；5)将步骤4)收集的酶活性部分上阴离子DEAE-Sepharose Fast Flow交换层析柱，用pH值7.0～8.0的磷酸缓冲溶液作梯度洗脱，盐梯度为0～0.8mol/LNaCl，收集酶活性部分；6)将步骤5)收集的酶活性部分经透析后上阳离子CM-Sepharose Fast Flow交换层析柱，用pH值5.0～5.8的醋酸缓冲液作梯度洗脱，盐梯度为0～0.8mol/L NaCl，流速控制在12ml/min，再收集酶活性部分；7)将步骤6)收集的活性部分上分子筛Sephadex G-100/SephadexG75柱，用pH值7～8的磷酸缓冲液洗脱，收集活性峰，活性峰用双蒸水透析，透析完全得样品溶液，用聚乙二醇20,000浓缩，冻干，即得含铁超氧化物歧化酶。本专利技术以新鲜海藻为原料，加入的磷酸缓冲液的pH值为7至8、浓度为50至100mmol/L，这样才能有效的抑制海藻中蛋白水解酶的活性，保证Fe-SOD酶的活性。本专利技术中，采用大功率超声破碎仪(3～5KW)进行超声破碎，显微镜检细胞完全破碎为止，使细胞内的Fe-SOD完全释放出来。本专利技术中，步骤2)将上清在50℃～55℃水浴中不断搅拌，在50℃大部分蛋白变性而沉淀，Fe-SOD能耐受较高温度仍溶解在上清液中，但水温一般不超过55℃，否则Fe-SOD将发生变性而失活。本专利技术中，步骤3)加入(NH4)2SO4采用分级盐析，每级盐析的时间一般6小时以上，以保证盐析完全。本专利技术中，步骤4)沉淀，用pH值7～8的磷酸缓冲液溶解，上Sephadex G-25柱脱盐，而不用透析方法，主要考虑工业生产的自动化，且快速省时省力，避免了透析法的烦琐。本专利技术，步骤5)和步骤6)中使用的柱层析，填充料采用Sepharose Fast Flow作为层析介质，一是Sepharose Fast Flow可承受较大压力使流速加快，提高分离效率，二是Sepharose Fast Flow可反复使用，不易破碎。本专利技术由于是从天然材料中提取铁超氧化物歧化酶(Fe-SOD)，海藻原料充足，不存在紧缺现象，同时材料成本相对于提取产品来说也是十分低廉。得到的产品比活相当高，活力损失相对较小，可以满足一般的医药需求，并且符合当代人“崇尚自然，回归自然”的心理需求，不存在转基因生产导致的基因污染问题。工艺中采用了DEAE-Sepharose Fast Flow和CM-Sepharose Fast Flow两种层析材料，其特点是流速快、可大量分离样品，同时可反复再生利用，能实现大规模工业化生产，具体实施方式以下通过实施例进一步说明本专利技术，但本专利技术并不局限于此实施例。实施例，包括以下步骤(1)取新鲜螺旋藻5Kg加入2倍体积pH值7.6、浓度为50mmol/L、含0.5mmol/L EDTA的磷酸缓冲液，冰浴超声波破碎，直至镜检细胞完全破碎为止。破碎液10000rpm、离心30min，取上清液。留样I，测酶活。(2)上清液在50℃水浴中，热变性处理1小时，期间用搅拌机不断温和搅拌，使加热均匀。(3)热处理后的样品溶液10000rpm、离心30min，取上清液。留样II，测酶活。高速离心后的上清液加(NH4)2SO4至45％饱和浓度，8小时后，10000rpm、离心30min，再取上清液。上清液继续盐析，加(NH4)2SO4至85％饱和浓度，8小时后，10000rpm、离心30min，取沉淀。(4)沉淀用pH值7.6、浓度为10mmol/L、含0.5mmol/L EDTA的磷酸缓冲液溶解，上Sephadex G-25柱(φ5×100cm)进行脱盐，用自动收集器收集酶活性部分。(5)脱盐后的样品溶液上阴离子DEAE-Sepharose Fast Flow交换层析柱。事先将已处理好的DEAE-Sepharose Fast Flow装入层析柱(φ10×60cm)中，用pH值7.6、浓度为10mmol/L、含0.5mmol/L EDTA的磷酸缓冲液平衡过夜，体积大约为柱体积的3～5倍。样品上柱，用pH值7.6、10mmol/L、含0.5mmol/LEDTA的磷酸缓冲液作梯度洗脱，盐梯度为0～0.8mol/L NaCl，收集酶活性部分。(6)将收集的酶活性部分用pH值5.5、浓度为2.5mmol/L、含0.5mmol/L EDTA的醋酸缓冲液透析，每隔2～3hr，换透析液1次共换4～5次。留样IV，测酶活。透析完全的样品溶液上阳离子CM-Sepharose Fast Flow交换层析柱。事先将已处理的CM-Sepharose Fast Flow装入层析柱(φ10×60cm)中，用pH值5.5、浓度为2.5mmol/L、含0.5mmol/L EDTA的醋酸缓冲液平衡过夜，体积大约为柱体积的3～5倍。样品上柱，用pH值5.5、浓度为2.5mmol/L、含0.5mmol/L EDTA的醋酸缓冲液梯度洗脱，盐梯度为0～0.8mol/L NaCl，流速控制在12ml/min，收集酶活性部分。(7)将收集的酶活性部分，上Sephadax G-100分子筛柱(φ5.0×100cm)。事先将已处理好的Sephadex G-100装入层析柱中，用pH7.6、浓度为10mmol/L、含0.5mmol/L EDTA的磷酸缓冲液平衡过夜，体积大约为柱体积的3～5倍。样品上柱后，用pH7.6，浓度为10mmol/L、含0.5mmol/L EDTA的磷酸缓冲液洗脱。流速控制在2ml/min，部分收集器收集酶活性峰，用重蒸水透析，每隔3～4hr换透析液本文档来自技高网...

【技术保护点】
海藻中提取含铁超氧化物歧化酶的方法，其特征是包括以下步骤： １）取新鲜海藻以１∶２～３的重量体积比加入ｐＨ值７～８、浓度为５０～１００ｍｍｏｌ／Ｌ、含０．５ｍｍｏｌ／Ｌ ＥＤＴＡ的磷酸缓冲液，将混和液进行超声破碎，破碎液离心，取上清； ２）将上清在５０℃～５５℃水浴中不断搅拌，进行热变性处理，去杂蛋白； ３）离心步骤２）所得上清液，加入（ＮＨ↓［４］）↓［２］ＳＯ↓［４］至饱和浓度４０～５０％，静置数小时，再离心、取上清，在上清液中加（ＮＨ↓［４］）↓［２］ＳＯ↓［４］至饱和浓度８５％，静置数小时，离心、取沉淀； ４）取步骤３）所得沉淀，用ｐＨ值７～８的磷酸缓冲液溶解，上Ｓｅｐｈａｄｅｘ Ｇ－２５脱盐柱，用自动收集器收集酶活性部分； ５）将步骤４）收集的酶活性部分上阴离子ＤＥＡＥ－Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ Ｆａｓｔ Ｆｌｏｗ交换层析柱，用ｐＨ７．０～８．０的磷酸缓冲溶液作梯度洗脱，盐梯度为０～０．８ｍｏｌ／Ｌ ＮａＣｌ，收集酶活性部分； ６）将步骤５）收集的酶活性部分经透析后上阳离子ＣＭ－Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ Ｆａｓｔ Ｆｌｏｗ交换层析柱，用ｐＨ值５．０～５．８的醋酸缓冲溶液作梯度洗脱，盐梯度为０～０．８ｍｏｌ／Ｌ ＮａＣｌ，流速控制在１２ｍｌ／ｍｉｎ，再收集酶活性部分； ７）将步骤６）收集的活性部分上分子筛Ｓｅｐｈａｄｅｘ Ｇ－１００／ＳｅｐｈａｄｅｘＧ７５柱，用ｐＨ值７～８的磷酸缓冲液洗脱，收集活性峰，活性峰用双蒸水透析，透析完全得样品溶液，用聚乙二醇２００００浓缩，冻干，即得含铁超氧化物歧化酶。...

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：龚兴国，曾冬云，周远，
申请(专利权)人：浙江大学，
类型：发明
国别省市：86[中国|杭州]