造血干/祖细胞体外分阶段共培养扩增技术制造技术

本发明专利技术提供一种造血干／祖细胞体外分阶段共培养扩增技术，采用已建系的骨髓间充质干细胞为培养体系的滋养细胞，与造血干细胞共培养，结合分阶段扩增的方法，构成了一个培养扩增技术的完整体系。本发明专利技术采用分阶段扩增和骨髓间充质干细胞共培养相结合的技术适当延长了造血干／祖细胞的体外扩增时间，并保证了延长的扩增期内扩增支持体系的活性，有效地提高了造血干／祖细胞的体外扩增倍数。（*该技术在2022年保护过期，可自由使用*）

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属生物工程技术，主要涉及一种造血干/祖细胞在体外扩增培养的生物技术方法，尤其是涉及造血干/祖细胞体外分阶段共培养扩增技术，能有效地提高造血干/祖细胞体外扩增倍数。目前上述两类技术方法一般采用的是一次性扩增法，造血干/祖细胞从进入培养体系(种植)到扩增结束(收获)，是一次性的。这种扩增方法虽然操作比较简单些，但往往限制了扩增时间，目前一般只能持续扩增10天左右，否则会造成扩增体系中的细胞因子耗竭或细胞因子活性降低而不利于继续提高造血干/祖细胞的扩增倍数和功能的激活。最近国外有在扩增中采取分阶段扩增、但未有同时应用骨髓间充质干细胞共培养的报道。本专利技术解决造血干/祖细胞体外扩增效率问题的技术方案是采用已建系的骨髓间充质干细胞(CD45-CD34-SH2+SH4+CD90+)为培养体系的滋养细胞，与造血干细胞共培养，结合分阶段扩增的方法，构成了一个培养扩增技术的完整体系。本专利技术提出的体外扩增程序是以造血干/祖细胞体外扩增态势(前6天内不扩增甚至数量下降，是对体外培养体系的适应期；6天后造血干/祖细胞开始扩增，是扩增期)为依据，为达到模拟体内造血干/祖细胞生长发育环境，并在适当延长体外扩增时间内能依然保持扩增支持体系活性的目的，把体外扩增程序分二个阶段进行，第一阶段是先在小容量培养条件下进行，加快造血干/祖细胞对条件的适应，第二阶段是转移至大容量培养条件下进行，加快造血干/祖细胞的增殖和分化速率。由此适当延长体外有效扩增时间，进一步提高造血干/祖细胞的扩增倍数。本专利技术提供的造血干/祖细胞体外分阶段共培养扩增程序，每个阶段培养培养骨髓间充质干细胞6-7天，至骨髓间充质干细胞在培养袋中铺层。实现本专利技术技术的具体步骤为(1)用培养液在小容量和大容量的培养袋中培养骨髓间充质干细胞约6-7天，直至骨髓间充质干细胞在培养袋中铺层。(2)去除培养袋中的培养液，再加入相应体积的造血干/祖细胞扩增培养液备用，该培养液可以是ADM培养液(Modified Ex-Vivo Expansion Medium)。造血干/祖细胞扩增培养液中加有三种细胞生长因子SCF、G-CSF和MGDF，每种细胞因子浓度为100 ng/mL。(3)从不同来源(脐带血或骨髓)分离单个核细胞或纯化CD34+细胞，首先种植到上述含有骨髓间充质干细胞层的小容量培养袋中，用小体积ADM培养液在5％CO2和37℃下培养6-7天。然后收获培养扩增的细胞，并转移到上述含有人骨髓间充质干细胞层的大容量培养袋中，用大体积ADM培养液继续培养6-7天。本专利技术技术的有益效果是分阶段扩增和骨髓间充质干细胞共培养相结合的技术适当延长了造血干/祖细胞的体外扩增时间，并保证了延长的扩增期内扩增支持体系的活性，有效地提高了造血干/祖细胞的体外扩增倍数。脐带血造血干/祖细胞的扩增中，CD34+细胞培养的有核细胞扩增了674倍(比报道单用骨髓基质细胞共培养的高5.7倍，比单用分阶段培养的高1.5倍)，CD34+细胞扩增了39.7倍(比报道单用骨髓基质细胞共培养的高3.6倍，比单用分阶段培养的高1.4倍)，粒-巨噬细胞集落形成细胞(GM-CFC)和高增殖潜能祖细胞集落形成细胞HPP-CFC分别扩增了92倍和71倍(比单用分阶段培养的分别高1.4倍和1.5倍)。新扩增技术具有明显的扩增优势。图2为两种培养体系中粒-巨噬细胞集落形成细胞(GM-CFC)和高增殖潜能祖细胞集落形成细胞(HPP-CFC)的扩增。图3为体外骨髓间充质干细胞共培养下的造血干/祖细胞扩增态势。图4为扩增细胞移植小鼠后各种细胞数量变化态势。图5为造血干/祖细胞体外扩增实验照片。具体实施实例本专利技术结合具体实施例作进一步说明。应理解，这些实施例仅用于说明目的，而不用于限制本专利技术范围。实施例1本专利技术技术采取的具体方法(1)用α-20培养液(AMEM/20％FBS)在小体积和大体积的Teflon培养袋中培养骨髓间充质干细胞约7天，直至骨髓间充质干细胞在培养袋中铺层。(2)去除培养袋中的α-20培养液，再加入相应体积的ADM培养液(造血干/祖细胞扩增培养液)备用。造血干/祖细胞扩增培养液中加有三种细胞生长因子SCF、G-CSF和MGDF，每种细胞因子浓度为100ng/mL。(3)从不同来源(脐带血或骨髓)分离单个核细胞或纯化CD34+细胞，首先种植到上述含有骨髓间充质干细胞层的小容量培养袋中，用小体积ADM培养液在5％CO2和37℃下培养7天。7天后收获培养扩增的细胞，并转移到上述含有人骨髓间充质干细胞层的大容量培养袋中，用大体积ADM培养液继续培养7天。实施例2脐带血造血干/祖细胞的体外扩增效果1.1 有核细胞的扩增从冻存的脐带血分离单个核细胞，并进一步分选出CD34+细胞，然后按本扩增技术体系进行体外扩增。在单个核细胞扩增培养中，有核细胞的数量都是先开始逐步下降，然后在第6-7天开始出现回升趋势，直至14天后收获细胞。CD34+细胞扩增培养中前期没有单个核细胞扩增那样的明显下降现象，但也是在第6-7天后出现扩增趋势，结果参见附图说明图1，图中—◆—为共培养体系，—■—为非共培养体系，图1a是单个核细胞培养的有核细胞扩增趋势(0-7天)，图1b是单个核细胞培养的有核细胞扩增趋势(7-14天)，图1c是CD34+细胞培养的有核细胞扩增趋势(0-14天)。14天后单个核细胞扩增培养中有核细胞扩增倍数是346；CD34+细胞扩增培养中有核细胞扩增倍数是674(表1)。表1 单个核细胞和CD34+细胞培养中有核细胞的扩增扩增细胞起始细胞(×106) 扩增细胞(×106) 扩增倍数单个核细胞 13.9 4,804345.6CD34+细胞 0.41 276.2673.71.2 GM-CFC和HPP-CFC的扩增单个核细胞培养和CD34+细胞培养的粒-巨噬细胞集落形成细胞(GM-CFC)和高增殖潜能祖细胞集落形成细胞(HPP-CFC)扩增效率见图2，图中A起始集落B非共培养扩增集落 C共培养扩增集落，图2a为GM-CFC的扩增，图2b为HPP-CFC的扩增。单个核细胞的起始GM-CFC和HPP-CFC分别是23×104和14×104；CD34+细胞的起始GM-CFC和HPP-CFC分别是9.4×104和1.8×104。经过14天的扩增后，单个核细胞扩增的GM-CFC和HPP-CFC分别是2048×104和716×104(分别扩增了89倍和51倍)；CD34+细胞扩增的GM-CFC和HPP-CFC分别是864×104和128×104(分别扩增了92倍和71倍)。1.3 扩增细胞的流式细胞仪分析扩增后的细胞用相应的单克隆抗体标记后进行流式细胞仪分析，其结果如表2。表2 扩增细胞膜表面抗原表型的比例(％)扩增细胞 CD33CD15CD14CD34CD34扩增倍数单个核细胞81 67 36 0.7790.2CD34+细胞 89 77 40 5.9 39.7扩增后的细胞中，大部分是CD33+和CD15+细胞。但是其所占的比率有所不同在单个核细胞扩增的细胞中CD33+和CD15+细胞分别为81％和67％，CD34+细胞扩增的细胞中CD33+和CD15+细胞分别为89％和77％。其次占比较大比例的是CD14+细胞本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种造血干／祖细胞体外分阶段共培养扩增技术，采用已建系的骨髓间充质干细胞（ＣＤ４５↑［－］ＣＤ３４↑［－］ＳＨ２↑［＋］ＳＨ４↑［＋］ＣＤ９０↑［＋］）为培养体系的滋养细胞，其特征是：滋养细胞与造血干细胞共培养，结合体外分阶段扩增程序进行。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：王金福，
申请(专利权)人：浙江大学，
类型：发明
国别省市：86[中国|杭州]