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抗蚜虫转基因小麦高效转化再生体系的建立技术制造技术

技术编号:1725232 阅读:179 留言:0更新日期:2012-04-11 18:40
一种抗蚜虫转基因小麦高效转化再生体系的建立技术,其特征是包括小麦胚性愈伤组织和悬浮细胞系的建立技术、小麦细胞转基因技术及抗虫转基因小麦的研制技术: (1)供试材料:为小麦栽培品种“石4185”、“河农859”、“河农326”等,麦长管蚜采集于田间; (2)表达载体构建:用SalⅠ和SacⅡ内切酶进行双酶切,从pIP840质粒上分离出GNA基因片段(505bp),插入到pBY505载体的Sma位点上,构建成质粒pBC98,GNA基因位于Act-1启动子的调控之下,选择基因为bar基因构建的pBC98质粒全长7.6Kb,宿主菌为E.Coli DH5a; (3)小麦胚性愈伤组织的诱导与培养:取小麦幼穗,用无菌镊子剥出幼穗,切成0.3-0.5cm长度的小段,或取二核期小孢子(花药)、剥离受粉10-15天的幼胚接种于愈伤组织诱导培养基上,25±1暗培养20-25天,诱导出的愈伤组织3-5周继代一次; (4)胚性愈伤组织细胞转化:利用基因枪法转化小麦细胞,轰击前4小时将愈伤组织接种在高渗培养基上进行预处理; (5)转化后的愈伤组织细胞的培养与再生:基因枪轰击后的细胞16小时后转入继代培养基上,恢复培养7天,取生长状态较好的愈伤组织转到含有除草剂的分化培养基上培养; (6)转基因植株的PCR和Southern杂交分析:为了测定抗小麦转基因植株是否含有整合的GNA基因片段,对叶片染色体DNA进行了PCR和Southern杂交分析; (7)转基因植株抗虫试验:将转化植株的新鲜叶片分别放入试管中,每试管接入蚜虫若虫10头,25℃温室培养,每隔半天取来源于同一编号植株的叶片将之替换,使试管内叶片保持新鲜,做3个重复,培养3-5天后,在成虫尚未繁殖之前,统计试管内虫体死亡的个数。(*该技术在2022年保护过期,可自由使用*)

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及生物新技术,特别是转基因小麦高效转化再生体系的建立方法。
技术介绍
在现有技术中,自1987年抗虫转基因植株公开报道以来,利用转基因技术表达杀虫基因成为综合防治害虫的重要途径之一。成功的研究是利用B.t(Bacillus thuringicnsis)杀虫蛋白基因来防治鳞翅目和鞘翅目害虫,而有许多同翅目害虫,如蚜虫、稻飞虱、叶蝉等在世界范围内对作物危害严重。小麦是华北地区种植面积最大的作物之一,在农业生产中占有主导地位。麦蚜是小麦主要害虫之一,其取食和分泌粘液不仅引进作物的直接损失和降低光和作用,而且口器刺入时产生伤口,传播十余种植物病毒,会造成严重的损失。目前,小麦转基因研究与应用相对滞后,远不如同为禾本科的水稻、玉米等作物品种,尤其是小麦栽培品种,普遍存在着愈伤组织胚性差,再生率低等特点,造成转化细胞的再生困难。这是目前限制小麦转基因研究与应用的主要因素之一。
技术实现思路
本专利技术的目的是为了提高小麦细胞转化再生率,提供一种转基因小麦高效转化再生体系。本专利技术的目的通过以下措施实现本技术包括小麦胚性愈伤组织和悬浮细胞系的建立技术、小麦细胞转基因技术及抗虫转基因小麦的研制技术,抗蚜虫转基因小麦高效转化再生体系的建立方法如下(1)供试材料为冬小麦(Tritum aestivum)栽培品种“石4185”、“河农859”、“河农326”等的幼穗、幼胚、花药、种子;麦长管蚜(Macrosiphum avevae)采集于田间。(2)表达载体构建用Sal I和Sac II内切酶进行双酶切,从pIP840质粒上分离出GNA基因片段(505bp),插入到pBY505载体的Sma位点上,构建成质粒pBC98。GNA基因位于Act-1启动子的调控之下,选择基因为bar基因。构建的pBC98质粒全长7.6Kb,宿主菌为E.Coli DH5a。(3)小麦胚性愈伤组织的诱导与培养取小麦幼穗,灭菌后,用无菌镊子剥出幼穗,切成0.3-0.5cm长度的小段,或取二核期小孢子(花药)、剥离受粉10-15天的幼胚接种于愈伤组织诱导培养基上,25±1暗培养20-25天。诱导出的愈伤组织3-5周继代一次。基因型和培养基是影响小麦花药、幼胚和幼穗培养效果的两个重要因素。我们选取了67个杂交组合和5个当前推广品种,主要利用C17、W14、N6、K3为基本培养基进行培养,花药愈伤组织诱导率多为10%-20%,最高可达96.6%。绿苗分化率一般为25%-45%,最高达92%。绿苗诱导率与愈伤组织诱导率呈正相关。对“石4185”、“中麦9”、“河农859”、“河农326”等7个品种的幼穗、幼胚进行培养,供试材料均有较高的愈伤组织诱导率和分化率,愈伤组织诱导率可达80%以上,绿苗分化率多在70%以上,2,4-D是诱导愈伤组织所必需的。小麦种子愈伤组织诱导率受基因型影响较大,一般为40%-60%之间。诱导出的愈伤组织一般比较松软,不适于悬浮培养或转化,必须对愈伤组织的生长状态进行调节。一般而言,在附加2,4-D的培养基上诱导产生的小麦愈伤组织较松软,大部分外层细胞是长弯型,原生质少,愈伤组织内部有一些较小的硬核,由细胞质不太浓、近等径型的细胞组成。此类愈伤组织胚性差、分化率低,不能建立真正的胚性细胞系。另一类愈伤组织结构紧密、生长慢、易分化。这两类愈伤组织均难以建立重复性强的高效率转化再生体系。所以必须对诱导出的愈伤组织进行调节,使之形成结构松脆、颗粒状胚性愈伤组织,获得理想的胚性细胞系。通过研究,小麦愈伤组织诱导与生长调节有以下特点a.激素2,4-D是小麦愈伤组织诱导和继代培养所必需的。b.降低2,4-D浓度可使外软内硬的愈伤组织向颗粒型方向转变,胚性增强。升高2,4-D浓度(2-8mg/L范围)可使结构紧密、生长缓慢的愈伤组织生长加快。c.培养基中附加低浓度细胞分裂素可使愈伤组织向颗粒型方面发展。d.含较低NH4+水平的培养基可明显抑制愈伤组织的过旺生长。e.在培养基中增加KCL(1000-2000mg/l)可增加愈伤组织活力。f.在培养基中附加水解酶蛋白、谷氨酰胺、天冬酰胺、精氨酸等可以改善愈伤组织的生长状态。g.用葡萄糖做碳源继代愈伤组织比用蔗糖效果好。诱导出的愈伤组织通过几次调节培养基的继代培养,逐渐形成颗粒状愈伤组织。在继代培养过程中应注意挑选那些颗粒特点明显,松脆型的愈伤组织。花药诱导的愈伤组织,开始就有颗粒特点,2-3个月就可以建立起胚性细胞系。在实际转基因研究中,主要用花药和幼胚愈伤组织作为转化的供试材料。挑取继代3-5次,分散性好的颗粒胚性愈伤组织进行液体悬浮培养,建立了“石4185”、“河农859”等的胚性细胞悬浮系。经过多种培养条件的优化,获得了主要小麦品种的胚性无性系,转化后保持了较高的再生频率。(4)胚性愈伤组织细胞转化;利用基因枪法转化小麦细胞。轰击前4小时将愈伤组织接种在高渗培养基上进行预处理。高渗培养基为在继代培养基中,分别加入甘露醇0.4mol/L、山梨醇0.4mol/L、甘露醇0.2mol/L+山梨醇0.2mol/L。取25μl钨粉载体于Eppendorf管中,加入5μl质粒DNA(1μg/μl),振荡混匀后加入25μl CaCl2(2.5mol/L),振荡,然后加入10μl亚精胺,离心去小清。用70%的乙醇80μl沉淀DNA,离心去小清后,重悬于15μl无水乙醇中备用。参照PDS1000/He型基因枪(Bio-Rad)说明对愈伤组织细胞进行轰击,每培养皿2次,氦气压力在1200Psi左右。(5)转化后的愈伤组织细胞的培养与再生基因枪轰击后的细胞16小时后转入继代培养基上,恢复培养7天,取生长状态较好的愈伤组织转到含有除草剂Bialaphos的分化培养基上培养,分化培养基为MS+KT2.0mg/L+NAA0.1mg/L,MS+ZT2.0mg/L+NAA0.1mg/L。转化前愈伤组织的高渗处理对再生率有明显影响,其中又以山梨醇0.2mol/L+甘露醇0.2mol/L的效果好。但由于高渗培养会抑制细胞的生长,因此,轰击后16小时必须将愈伤组织转入MS+2,4-D2.0mg/L的继代培养基上恢复培养。经基因枪转化后的小麦愈伤组织或细胞在含有8.0mg/L除草剂Bialaphos的再生培养基上培养,少量愈伤组织细胞可以继续生长,并再生出完整植株。将再生植株植入土壤,待植株长至20-30cm时,用1%Basta除草剂进行叶片涂抹,一周后,处理过的未转化植株的叶片变黄死亡,而转化后的植株表现对Basta的抗性。具有抗性的植株可以视为转基因植株。通过筛选得到了百余株(lines)小麦转基因株系。(6)转基因植株的PCR和Southern杂交分析为了测定抗Basta小麦转基因植株是否含有整合的GNA基因片段,对叶片染色体DNA进行了PCR和Southern杂交分析。根据GNA基因的编码序列设计引物引物1TCCTTGGTGTCATCACACCATCTTGCCCTG引物2GAATTCCAACAAGTCCGGTGTGAGTTCCAG 结果扩增得到了372bp的GNA基因片断,用在32p标记的0.5kbGNA cDNA探针杂交,结果92%的转化植株为杂交阳性证实小麦转基因植株中整合了DNA基因。(7)转基因植株抗虫试本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员:朱宝成杨学举梁玉玲韩继刚温树敏曲占良郎明林赵建军王建辉燕飞薛庆林陈荣敏谷维娜杜俊岭
申请(专利权)人:河北大学
类型:发明
国别省市:

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