肿瘤坏死因子受体可溶部分的重组基因，及其融合基因与产物制造技术

本发明专利技术提供了一种重组ｓＴＮＦＲ基因，其中的密码子符合哺乳动物细胞使用密码子的偏爱性。本发明专利技术还提供一种包含该重组基因的融合基因。当本发明专利技术的基因或融合基因表达时，其在ＣＨＯ细胞中的表达量提高了近５倍，所得融合蛋白的亲和力提高了一个数量级。（*该技术在2021年保护过期，可自由使用*）

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及肿瘤坏死因子α(TNFα)受体尤其是其可溶部分的重组基因，以及含该重组基因的融合基因及其产物。
技术介绍
肿瘤坏死因子(TNF)是机体内的一种多功能免疫调节分子，它可以和细胞膜上的受体结合发挥作用，往往引起靶细胞的死亡(它的名称即来源于此)或招引免疫效应细胞在局部的聚集。国外对类风湿关节炎(Rheumatoid Arthritis，RA)的发病机理进行研究发现，肿瘤坏死因子α(TNF-α)在该疾病的病理进程中起十分关键的作用，患者或动物模型病变关节腔内的TNF水平异常升高(Feldman M，Brennan FM，Maini RN.The role of cytokines in rheumatoid arthritis.Ann RevImmunol 1996；14397；Grom A，Murray KF，Luyrink L等，Patterns ofexpression oftumor necrosis factor a，tumor necrosis factor β，and their receptors in synovia ofpatients with juvenile rheumatoid arthritis and juvenile spondyloarthropathy.ArthritisRheum 1996，391703；Saxne T，Palladino Jr MA，Heinegard D等，Detection oftumor necrosis factor alpha but not tumor necrosis factor beta in rheumatoid arthritissynovial fluid and serum.Arthritis Rheum 1988；311041；Klareskog L和McDevitt HRheumatoid arthritis and its animal modelsthe role of TNF-α and the possibleabsence of specific immune reactions.Current Opinion in Immunology，1999；11657-662))。它在关节腔内的含量大量升高，一方面和关节滑膜细胞的受体结合造成该细胞直接损伤，另一方面，它可以召集免疫效应细胞聚集至此，分泌更多的细胞因子，产生更强更持久的自身免疫反应。在RA病患部位有过量的TNF-α表达，是造成患病部位肿胀和疼痛的主要因素之一。而且有大量研究表明，TNF还是引起脓毒性休克综合症的主要介质。脓毒性休克综合症患者血清中TNF-α水平升高预示着死亡率或致残率升高。被动输入TNF-α的拮抗剂可以防止LPS和细菌引起的休克合组织损伤，临床上应用TNF-α抗体或者其受体对类风湿关节炎和脓毒性休克综合症有一定疗效。对TNF受体(TNFR)的研究表明，有I型、II型两种肿瘤坏死因子受体，均为I型跨膜糖蛋白。其中以II型分布更为广泛，与肿瘤坏死因子的亲和力更强。两种受体虽然需位于细胞膜上才可以发挥向细胞内传递信号的功能，但仍有部分从细胞表面脱落至体液内，称为可溶性受体。进一步的研究表明，这种可溶性的受体可以中和TNF，在体内对TNF的活性起负调节作用(Smith CA，Farrah T，Goodwin RG.The TNF receptor superfamily of cellular and viral proteinsactivation，costimulation，and death.Cell 1994；75959.)，但是由于这种可溶性受体的体内半衰期很短，即使能够人工合成这种受体分子，用来治疗RA也是不现实的。国外已有人借助基因工程手段构建了人TNFαII型受体可溶部分(sTNFR)与人抗体IgG Fc片段的融合蛋白，研究发现该融合蛋白在离体条件下对TNF有中和作用，因此有可能开发成功治疗RA的特效药物(参见Hoogenboom等，分子免疫学28(9)1027-1037，1991，“Ab-TNF融合蛋白的构建与表达”；美国专利5,605,690)。专利技术目的本专利技术的目的在于提供一种重组的sTNFR基因，它能够提高在哺乳动物细胞内的表达。本专利技术的目的还在于提供一种含有该重组基因的融合基因，以及由此得到的融合蛋白，该蛋白具有更强的免疫亲和力。本专利技术的目的还在于提供含有本专利技术重组基因的重组载体，可转染哺乳动物细胞而实现高表达。本专利技术的目的还在于提供含有本专利技术重组载体的哺乳动物细胞。技术方案为了实现本专利技术的目的，本专利技术提供了一种新的重组sTNFR基因，其中的密码子符合哺乳动物细胞使用密码子的偏爱性，所述重组基因的序列为SEQ IDNO1gtagctgtgt gcgcagctct cgcggtgggt ctcgacctgt gcgcagcagc tcaggcgttc 060ccagcacacg tagctttgac cccataggca cctgacccag gtaggacttg gcgactgagt 120gattagtacg agcacacggc acacatctgt tggaggaagt ggtcaccagg tcagcaggct 180aaggtgttgt gcacgaacac gtctgaaacg gtctgagagt cgtgagacga gaggacgtag 240acgcacctgt gcaagtgcgt accggactgg ttcagatgcg gatcgcgttg cagttcggag 300cacgtcgaca cacaggcatg gacgcgagat cacaagcgaa tgtgcacgtg aaggcctgga 360tggtactgcg ccctaaggaa ccatgacgga tggcgactct gggcacctct ccgaaattgg 420cgaccaggtt taggagtcgc aagtcctggt acggacacct ctgaggttgt ctggaaccca 480g 481为了克隆与表达的目的，本专利技术在该序列在该结构基因前增加了一段操作序列CATgctagcATG。其中，前3个大写碱基表示的保护碱基，下划线部分是NheI酶切位点，其后是加入的起始密码子ATG。本专利技术还提供了包含该重组基因的融合基因。其中，重组sTNFR基因与人IgG Fc片段的融合。在本专利技术的一种优选实施方式中，重组sTNFR基因通过一段接头序列与人IgG Fc片段的融合，其编码的氨基酸序列为(Ala3Ser2)5(SEQ ID NO2)。该氨基酸序列的DNA序列之一为5’-ACCACAACCT CGTCAACCAC AACCTCGTCA ACCACAACCTCGTCAACCAC AACCTCGTCA ACCACAACCT CGTCA-3’(SEQ ID NO3)。本专利技术的目的还在于提供含有本专利技术重组基因的重组载体，可转染哺乳动物细胞而实现高表达。所述的载体可以是本领域熟知的各种适合转染哺乳动物的表达载体。本专利技术的目的还在于提供含有本专利技术重组载体的哺乳动物细胞。所述的哺乳动物细胞可以是例本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种重组ｓＴＮＦＲ基因，具有ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１所述的序列。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：马菁，徐身东，
申请(专利权)人：上海中信国健药业有限公司，
类型：发明
国别省市：31[中国|上海]