人肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体突变蛋白、其制法及其药物组合物制造技术

本发明专利技术公开了一种新的具有Ｓｅｒ５２Ａｓｎ和Ｔｒｐ８２Ｇｌｎ突变的人肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体突变蛋白，编码该突变蛋白的ＤＮＡ序列，含有该ＤＮＡ序列的表达载体，用该表达载体转化的宿主细胞，含有该突变蛋白的药物组合物，以及该突变蛋白的制备方法。该突变蛋白的亲和力大大高于天然蛋白，而且其在宿主细胞中的表达量也有所提高。（*该技术在2021年保护过期，可自由使用*）

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及生物
具体地说，本专利技术涉及一种亲和力和表达量有所提高的人肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体突变蛋白。另外，本专利技术还涉及该突变蛋白的制备方法以及含有该突变蛋白的药物组合物。
技术介绍
目前临床上对肿瘤患者的治疗仍大多采用手术切除联合化学疗法和放射疗法，这一传统疗法虽然能去除瘤体并杀死部分癌细胞，但由于其非特异性杀伤作用，使得患者的大量正常组织细胞被杀死，导致患者的机体健康受到重大损伤，同时也无法防治肿瘤的复发和转移。当前兴起的生物治疗和基因治疗为彻底根治肿瘤带来了曙光，近期研究发现了一种能特异性杀伤肿瘤细胞的蛋白-TRAIL(TNF related apoptosis inducing ligand，肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体)，由于其独特的抗癌作用而为世人瞩目。人TRAIL基因位于染色体3q26，由美国科学家Wiley等人首先发现并于1995年克隆、命名。TRAIL属于肿瘤坏死因子家族成员，为典型的II型跨膜蛋白，整个分子由281个氨基酸组成，C端细胞外区域形成同源三聚体的亚结构，而N端氨基酸为疏水区并形成跨膜结构，其受体分为五种，其中R1、R2为坏死受体(necrosisreceptor)，R3、R4为诱骗受体(seduction receptor)，R5为一种分泌性受体。TRAIL与死亡受体R1、R2结合将导致细胞凋亡，而与诱骗受体R3、R4结合，则可使细胞逃脱TRAIL诱导的细胞凋亡。现在实验表明正常细胞可同时表达死亡受体与诱骗受体，而肿瘤及转化细胞仅能表达死亡受体或约高于正常细胞100倍的死亡受体和低于正常细胞10倍的诱骗受体。因此TRAIL能特异性地诱导多种肿瘤细胞死亡，而对正常组织细胞无影响。许多实验已证实纯化的人TRAIL能引起白血病9D细胞和EB病毒转化的人B细胞数量明显减少；在2小时内可诱导人急性白血病Jurkat细胞、9D细胞的DNA片段化而导致细胞死亡。同样TRAIL对Burkitt’s淋巴瘤B细胞系、急性人白血病T细胞系有相同的杀伤作用。同时TRAIL对人肿瘤细胞如Hela、U937、A549和ME180人宫颈癌细胞的杀伤作用比对照显著增强。在体内，TRAIL能诱导突变的T淋巴细胞凋亡，如恶变的T细胞、HIV(爱滋病毒)感染的T细胞等。综上所述，由于TRAIL具有显著地特异性杀伤肿瘤细胞的功能，许多科学家预计，其社会效益及经济效益不可估量。然而，目前的TRAIL仍然存在着亲和力不够高的问题。在生产过程中，其表达量也很低，只有5％(参见Wiley SR，等人，1995，“诱导凋亡的TNF家族新成员的鉴定和特性分析”，Immunity，3(6)673-682)。因此，本领域中仍迫切需要提供一种亲和力以及表达量有所改善的TRAIL。
技术实现思路
为了满足上述专利技术目的，本专利技术的一个方面提供了一种分离的人肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体突变蛋白，该突变蛋白具有Ser52Asn和Trp82Gln突变。在一个较佳的实例中，该突变蛋白具有如SEQ ID NO1所示的氨基酸序列。本专利技术另一方面提供了一种编码本专利技术上述突变蛋白的DNA序列。在一个较佳的实例中，该DNA序列具有如SEQ ID NO2所示的核苷酸序列。本专利技术第三方面提供了含有本专利技术DNA序列的表达载体。本专利技术第四方面提供了经上述表达载体转化的宿主细胞。在一个较佳的实例中，所述宿主细胞是大肠杆菌、枯草杆菌或酵母细胞。本专利技术第五方面提供了一种药物组合物，该药物组合物含有药学上有效量的上述人肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体突变蛋白以及药学上可接受的载体。本专利技术第六方面提供了本专利技术的人肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体突变蛋白的制备方法，该方法包括a)提供一表达载体，该表达载体含有编码上述突变蛋白的DNA序列以及与该DNA序列操作性相连的表达调控序列；b)用步骤a)中的表达载体转化宿主细胞；c)在适合表达上述突变蛋白的条件下培养步骤b)所得的宿主细胞；和d)分离纯化所表达出的突变蛋白。本专利技术的优点在于上述人TRAIL突变蛋白的亲和力比天然的TRAIL蛋白更高，而且其在宿主细胞中的表达量也有所提高。本专利技术的其它目的和优点可通过下面的详细描述得知。专利技术详述本专利技术提供了一种具有Ser52Asn和Trp82Gln突变的分离的人肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体突变蛋白。本文所用的术语“人肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体蛋白(TRAIL)”可以是具有天然野生型序列的人TRAIL蛋白，也可以是具有突变序列的衍生型或重组人TRAIL蛋白，只要该突变序列中不包括Ser52Asn和Trp82Gln突变即可。天然的人肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体蛋白的氨基酸序列及其编码序列如SEQ ID NO3和SEQ ID NO4所示。本专利技术者通过研究发现，通过将该蛋白质氨基酸序列的52位丝氨酸(Ser)和82位色氨酸(Trp)分别突变成天冬酰胺(Asp)和谷酰胺(Gln)，可使突变后的蛋白的亲和力及其在宿主中的表达量均大大提高。本文中所用的术语“Ser52Asn”和“Trp82Gln”即表示52位氨基酸由Ser变为Asn，82位氨基酸由Trp变为Gln。不希望受理论的束缚，认为上述两处氨基酸很可能构成了该蛋白质的活性中心，因此，将这两处氨基酸突变成疏水性强的氨基酸导致了该蛋白的亲和力提高。另外，还发现上述突变蛋白在宿主细胞中的表达量也得到大大提高。在本专利技术的一个较佳实例中，本专利技术的突变蛋白具有SEQ ID NO1所示的氨基酸序列。本文所用的术语“分离的”在用于核酸或蛋白质时，表示核酸或蛋白质基本上不含其它在天然状态下相关的细胞成分，其最好呈均质状态，但也可以是干的或水溶液。纯度和均一性通常可用分析化学方法如聚丙烯酰胺凝胶电泳或高效液相色谱法来测定。本专利技术还提供了一种编码本专利技术上述肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体突变蛋白的DNA序列。在一个较佳的实例中，所述DNA序列具有SEQ ID NO2所示的核苷酸序列，其中核苷酸序列中第154-156位碱基TCT和第244-246位碱基TGG分别替代了编码天然TRAIL蛋白的DNA序列中的碱基AAT和GAT。当然，本领域技术人员也可利用本领域中熟知的遗传密码的简并性获得编码上述氨基酸序列的所有其它核酸序列。本专利技术的突变蛋白可通过以下方法来进行制备。首先，提供含有编码本专利技术突变蛋白的核苷酸序列以及与该序列操作性相连的表达调控序列的表达载体。本文所用的术语“表达调控序列”通常指参与控制核苷酸序列表达的序列。表达调控序列包括与目标核苷酸序列操作性相连的启动子和终止信号。它们通常还包括核苷酸序列适当翻译所需的序列。“操作性相连”是指线性DNA序列的某些部分能够影响同一线性DNA序列其他部分的活性。例如，如果启动子或增强子增加了编码序列的转录，则它与编码序列是操作性相连的。上述编码突变型TRAIL蛋白的DNA序列可用本领域技术人员熟知的常规手段来获得，例如，根据已经公开的人TRAIL蛋白的DNA序列来合成引物进行PCR法扩增，或用诸如定点诱变、盒式诱变和聚合酶链反应(PCR)诱变等方法进行诱变。在获得了具有定点突变后的DNA序列后，就可通过本领域熟知的各种方法将其连入合适的表达载体中。本专利技术中所用的表达载体是本领域技术人员已知的各种市售的表达载本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种分离的人肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体突变蛋白，其特征在于，它含有Ｓｅｒ５２Ａｓｎ和Ｔｒｐ８２Ｇｌｎ突变。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：胡辉，刘庆法，
申请(专利权)人：上海中信国健药业有限公司，
类型：发明
国别省市：31[中国|上海]