一种角蛋白酶的固态发酵制备方法及其应用技术

技术编号:1725201 阅读:228 留言:0更新日期:2012-04-11 18:40
本发明专利技术公开一种角蛋白酶的固体发酵制备方法及其应用,其制备方法按如下步骤操作:1)采用常规微生物接种方法接种:试管斜面培养,采用察氏固体培养基;移接(酶生产),将上述生长的菌株移接到产孢固体培养基中,25~32℃,培养3~5天,至孢子产生;步骤1)中以真菌为菌种,步骤2)将所述菌株孢子按0.5~10%接种量投加到固体培养基中,控制碳:氮的比例在2~5∶1~3.5范围内,加入无机磷,其含量为5~8μmol/g.干基,保持湿度30~70%,温度25~32℃,自然pH值,角蛋白酶产生时间为40~120小时;作为饲料添加剂用。本发明专利技术产酶活力高、易于生产应用。(*该技术在2021年保护过期,可自由使用*)

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及角蛋白生物降解技术,具体地说是角蛋白酶的固态发酵制备方法及其应用
技术介绍
蛋白质是制约现代饲养业发展的重要物质。角蛋白在我国资源丰富,是一种理想的动物蛋白,其蛋白质含量高达95%以上。传统的角蛋白水解方式主要为高温高压蒸煮或酸水解,属于物理化学处理工艺,其工艺条件苛刻,易对热敏氨基酸造成破坏,动物利用率低,并造成环境污染。然而,生物降解是发展趋势,利用角蛋白酶分解角蛋白,氨基酸转化率大幅度提高,能有效地解决上述弊端,应用效果显著,并改善我国以植物蛋白为主及动物蛋白缺乏的局面,维持动物体内的氨基酸平衡。专利号为4,908,220的美国专利(C.M.Williams.1990.U.S.Patent 4,908,220)公开一种用细菌角蛋白酶水解角蛋白方法,它通过液体发酵制备角蛋白酶,用角蛋白材料生产氨基酸或水解的羽毛产品作为饲料添加剂),具体是采用细菌(芽孢杆菌属Bacillus licheniformis)为菌种,其角蛋白酶的分子量为33kDa;最适作用温度50℃;最适pH7.5;液体深层发酵,发酵周期4天,属生物降解技术,主要目的在于环境废弃物的处理。但其采用液体发酵制备角蛋白酶工艺较复杂,其角蛋白酶活力还不够理想。
技术实现思路
本专利技术提供一种产酶活力更高、工艺简单、易于生产应用的角蛋白酶的固态发酵制备方法及其应用。为了实现上述目的,本专利技术的技术方案是按如下步骤操作1)采用常规微生物接种方法接种试管斜面培养,采用察氏固体培养基;移接将上述生长的菌株移接到产孢固体培养基中,20~32℃,培养3~5天,至孢子产生;其特征在于步骤1)中以真菌为菌种,步骤2)将所述菌株孢子按0.5~10%接种量投加到固体培养基中,控制碳∶氮的比例在2~5∶1~3.5范围内,加入无机磷,其含量为5~8μmol/g·干基,保持湿度30~70%,温度25~32℃,自然pH值,角蛋白酶产生时间为40~120小时;所述菌株孢子添加到固体培养基中的接种投加量为1~5%;所述保持湿度为50~60%;所述固体培养基中的碳为谷糠或麦麸;所述固体培养基中的氮为麦麸或羽毛粉;所述无机磷为磷酸氢二钾和磷酸二氢钾,两者重量比为1∶1~1.5;所述真菌菌种为曲霉属中的栖土曲霉;所述角蛋白酶产生时间较好为60~90小时;角蛋白酶产生时间最佳为72小时。按所述方法制备的角蛋白酶的应用是将所述角蛋白酶培养物直接作为饲料添加剂,添加到蛋白或角蛋白饲料中,添加量为饲料的2~10%;或将所述角蛋白酶培养物用水浸提,加硫酸铵沉淀,控制硫酸铵饱合度为30~60%,离心干燥,制成粗酶制剂作为饲料添加剂,将所述粗酶制剂添加到蛋白或角蛋白饲料中,添加量为饲料的0.5~5‰。本专利技术具有如下优点1.易于生产应用。本专利技术角蛋白酶用固态发酵方式制成,易于培养繁殖、生产,所采用的菌株抗逆性强,较液体深层发酵时间提前了30小时,生产工艺简便,且无需精制,仅经浸提、盐析步骤,得粗酶即可应用,也可直接应用,易于推广。2.具有高的产酶能力和降解率。采用本专利技术对角蛋白的降解不施加高温、高压,属生物降解,降解率较高,体外消化率达到89%;具有广谱的底物水解活性和温度、pH耐受能力。产酶活力为4000单位/克曲;体外消化率达到89%。分子量为39Kda;最适作用温度50℃;最适pH8.0。3.具有广阔的应用前景。本专利技术生产的角蛋白酶可以作为饲料添加剂,调整饲料蛋白的结构,在保持氨基酸平衡的情况下使其接近动物蛋白的营养,提高了饲料转化率,增加了饲料报酬;在动物的商业性饲养中,产生大量的羽毛、毛发底物,这些物质的堆积导致环境污染并成为各种病原体滋生的温床,而角蛋白酶及其产生菌将成为使含角蛋白的废物价值化的良好的生物技术工具。另外,角蛋白酶能够改善皮肤外用药物在硬蛋白中的通透性,达到治疗皮肤病如甲癣的目的,研究角蛋白酶,对揭示皮肤真菌感染分子机制具有重要价值,角蛋白酶可以促进化妆品深层护理,帮助活性因子透过皮肤屏障,祛除皮肤多余角质由于其角蛋白酶具有恢复皮肤弹性的作用。具体实施例方式实施例1角蛋白酶的制备按如下步骤操作1)以曲霉属真菌为菌种,名为栖土曲霉(Aspergillus terricola),购于中国科学院北京微生物研究所,所述栖土曲霉,形态特征为菌株在察氏培养基上,气生菌丝生长良好,棉絮状,有突起,表面白色,背面颜色随时问延长由浅褐色变为褐色,孢子为褐色;采用常规微生物接种方法接种试管斜面培养,采用察氏固体培养基;移接(酶生产)将上述生长的菌株移接到产孢固体培养基中,28℃,培养3天,至孢子产生;所述产孢培养基采用20%马铃薯浸出汁1000ml,葡萄糖10g,磷酸二氢钾3g,硫酸镁1.5g,维生素B1微量,琼脂20g,在每一个斜面试管放一滤纸条;2)将所述菌株孢子按3%接种量投加到固体培养基中,所述固体培养基中的碳为谷糠,氮为麦麸,磷为磷酸氢二钾,控制碳∶氮的比例为4∶3,加入无机磷,其含量为6μmol/g·干基,其中磷酸氢二钾和磷酸二氢钾重量比为1∶1,保持湿度60%,温度28℃,pH为自然值,72小时为角蛋白酶产生高峰;将产生的角蛋白酶直接作为饲料添加剂,添加量为饲料的5%。本专利技术分解原理为本专利技术不施加高温、高压,将角蛋白转化为氨基酸,其降解过程为生物化学反应过程。结果参数较现有技术中液体深层发酵时间提前了30小时,产酶活力为4000单位/克曲;体外消化率达到89%。分子量为39Kda;最适作用温度50℃;最适pH8.0;发酵周期3天,为固态发酵;采用本专利技术所述角蛋白酶作为饲料添加剂,具有广谱的底物水解活性和温度、pH耐受能力。我国的饲料蛋白多以植物蛋白为主,必需氨基酸的含量较低,易造成氨基酸的不平衡。最常见的角蛋白是羽毛粉,接近于动物蛋白。作为商业性禽类加工的副产物,其成份中粗蛋白(CP)含量一般在80%以上,有时可高达97%。羽毛粉中胱氨酸Cys含量较高,一般为4~5%,远高于其他动植物蛋白质,β-角蛋白更是富含谷氨酸Gly、丙氨酸Ala和丝氨酸Ser等。本专利技术生产的角蛋白酶可以作为饲料添加剂,调整饲料蛋白的结构,在保持氨基酸平衡的情况下使其接近动物蛋白的营养,提高了饲料转化率,增加了饲料报酬;其羽毛底物酶解氨基酸含量变化(条件40℃,水浴保温6小时)见表1。表1羽毛底物酶解氨基酸含量变化(mgL-1)氨基酸A B氨基酸 A B 氨基酸 A BASP 天冬 87.485.3 CYS 胱18 12 PHE 苯丙 138 49THR 苏 92 39.4 VAL 结19578 LYS 赖 3733SER 丝 165 122 MET 蛋30 24 NH3 氨 7266GLY 谷 185 62 ILE 异亮 12754 HIS 组 7 6GLU 甘 105 40 LEU 亮17567 ARG 精 5112ALA 丙 117 17 TYR 酪45 12 PRO 脯 2619其中A为酶解羽毛样品,B为羽毛样品在动物的商业性饲养中,产生大量的羽毛、毛发底物,这些物质的堆积导致环境污染并成为各种病原体滋生的温床。而角蛋白酶及其产生菌将成为使含角蛋白的废物价值化的良好的生本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种角蛋白酶的固态发酵制备方法,按如下步骤操作:1)采用常规微生物接种方法接种:试管斜面培养,采用察氏固体培养基;移接:将上述生长的菌株移接到产孢固体培养基中,20~32℃,培养3~5天,至孢子产生;其特征在于:步骤1)中以真菌为菌种,步骤2)将所述菌株孢子按0.5~10%接种量投加到固体培养基中,控制碳∶氮的比例在2~5∶1~3.5范围内,加入无机磷,其含量为5~8μmol/g.干基,保持湿度30~70%,温度25~32℃,自然pH值,角蛋白酶产生时间为40~120小时。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员:曹军张成刚郝林唐晓萌
申请(专利权)人:中国科学院沈阳应用生态研究所
类型:发明
国别省市:89[中国|沈阳]

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