人干扰素α的表达和分泌载体及通过使用这种载体产生人干扰素α的方法技术

本发明专利技术公开了一种分泌性产生人干扰素α（ｈＩＦＮα）的表达载体，包含一种编码修饰的大肠杆菌耐热肠毒素ＩＩ信号序列的多核苷酸，和一种连接于其３’末端的编码ｈＩＦＮα的多核苷酸；用所述表达载体转化的微生物；以及通过培养所述微生物分泌性产生人干扰素的方法，所述方法能将可溶形式的活性ｈＩＦＮα分泌进大肠杆菌细胞周质中，所述可溶形式的活性ｈＩＦＮα在其Ｎ末端没有附加的甲硫氨酸残基。（*该技术在2021年保护过期，可自由使用*）

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及一种分泌性产生人干扰素α(hIFNα)的表达载体，其包含一种编码修饰的大肠杆菌耐热肠毒素II信号序列的多核苷酸和一种连接于其3’末端的编码hIFNα的多核苷酸；本专利技术还涉及一种用这种表达载体转化的微生物；和一种在大肠杆菌细胞周质中分泌性产生hIFNα的方法，所述hIFNα在其N末端没有添加甲硫氨酸。人干扰素是细胞因子蛋白，其抑制体内免疫应答或病毒复制，而且根据产生它们的细胞类型将干扰素分为干扰素α(IFNα)，干扰素β(IFNβ)和干扰素γ(IFNγ)(Kirchner，H.等，Tex.Rep.Biol.Med.，418993，1981；Stanton，G.J.等，Tex.Rep.Biol.Med.，4184-88，1981)。已经熟知这些干扰素在抗病毒，抗癌，NK(天然杀伤)细胞活化和骨髓细胞抑制活动中一起发挥协同作用(Klimpel等，免疫学杂志12976-78，1982；Fleischmann，W.R.等，国际癌症研究杂志65863-966，1980；Weigent，等，感染免疫学，4035-38，1980))。另外，干扰素可以作为基因在细胞中表达，结构和功能的调节因子，并示出直接抗增殖作用。IFNα是在白细胞受到B细胞促分裂原、病毒或癌细胞刺激时产生的。到目前为止，已经报道了编码20种以上干扰素的基因，每种基因均含有165或166个氨基酸。用于早期临床试验的IFNα是从用Sendai病毒刺激棕黄层白细胞时获得的，而且其纯度仅在1％以下(Cantell，K.和Hirvonen，Tex.Rep.Biol.Med.，35138-144，1977)。在20世纪80年代已经可以通过基因重组方法产生大量具有生物物理学活性的IFNα(Goedell，D.V等，自然287411-416，1980)。使用重组IFNα的临床试验已经示出其在治疗各种固体癌症，尤其膀胱癌，肾癌，HIV相关的Kapos′s肉瘤等疾病中是有效的(Torti，F.M.，J.Clin.Oncol.，6476-483，1988；Vugrin，D.等，Cancer Treat.Rep.，69817-820，1985；Rios，A.，等，J.Clin.Oncol.，3506-512，1985)。其在治疗丙型肝炎病毒中也是有效的(Davis，G.G等，N.Engl.J.Med.，3211501-1506，1989)，而且其作为治疗剂的可应用范围一天天扩大。从白细胞中克隆IFNα基因的结果示出IFNα是由一组至少10种不同的基因编码的。这表明基因的DNA序列不是产生一种蛋白质，IFNα是具有相似结构的亚型蛋白的混合物。这种亚型蛋白称为IFNα-1，2，3，依此类推(自然，29020-26，1981)。在一些类型的干扰素中，纯化自人白细胞的hIFNα的分子量为17,500-21,000，并具有非常高的大约2×108IU/mg蛋白质的天然活性。在体外，IFNα是一种由165个氨基酸组成的蛋白质。当第23位氨基酸是赖氨酸时，其被称为IFNα-2a(SEQ ID NO1)，当第23位氨基酸是精氨酸时，其被称为IFNα-2b(SEQ ID NO2)。在开始阶段，hIFNα是使用细胞培养的方法产生的。然而，这种方法不适于商业化，因为其产量较低，大约为250ug/L。为解决这个问题，通过使用基因重组方法从微生物中回收大量干扰素的方法已经研制并使用。最广泛应用的是一种使用大肠杆菌的方法，其根据大肠杆菌细胞的特性，产生由166或167个氨基酸组成的IFNα。这些产物具有额外的甲硫氨酸残基，这些残基是通过存在于起始密码子位点的ATG密码子的作用添加在N末端。然而，已经有报道在人生长激素的情况中，添加的甲硫氨酸残基能引发有害的免疫应答(EP专利出版物No.256,843)。另外，大多数表达的hIFNα以不溶的包含体形式累积在细胞质中，而且在纯化期间必须通过重折叠转变为活性形式。由于这种重折叠方法不是有效的，因此hIFNα部分以还原形式存在，或形成分子内二硫键偶联体或缺陷的二硫键偶联体。这些副产物很难除去，由此导致非常低的产量。尤其地，非常难以除去非所需的干扰素副产物如错误折叠的干扰素。近年来为解决与在微生物细胞内产生外源蛋白相关的上述问题，进行了各种努力以研制一种基于有效分泌可溶形式的不携带添加在N末端的额外甲硫氨酸的靶蛋白的方法。在这种方法中，所需的蛋白是以融合蛋白的形式表达的，其携带一个附着于其N末端的信号肽。当融合蛋白穿经细胞膜时，通过大肠杆菌中的酶除去信号肽，而且所需蛋白是以天然形式分泌的。分泌性生产方法比微生物生产方法更有优势，其中产生的蛋白质的氨基酸序列和较高级的结构通常与野生型的相同。然而，分泌性生产方法的产量通常非常低，因为其在细胞膜转运和随后的纯化过程中不是很有效。因为在原核细胞生物中以分泌的形式产生的哺乳动物蛋白的产量比在原核细胞中以相同方式产生的原核细胞性蛋白产量更低。因此，已经尝试研制一种更有效的分泌性生产方法。例如，韩国专利出版物No.93-1387揭示了一种使用大肠杆菌碱性磷酸酶大量生产IFNα的方法，但这种方法的产量是非常低的，为109IU/L培养基(10ug/L培养基)。因此，热切希望研制出一种方法，这种方法可以使用微生物大量生产可溶性IFNα，而且不具有添加在N末端的额外的甲硫氨酸残基。本专利技术人预先产生了大肠杆菌耐热肠毒素II的一种新的信号肽(韩国专利申请No.98-38061和99-27418)，并发现这种新的分泌性信号肽可以用于大量生产天然形式的IFNα。即本专利技术人已经构建了一种表达载体，其含有一种通过将IFNα编码基因而不是肠毒素II编码基因连接于修饰的大肠杆菌分泌性信号肽而获得的基因，并研制了一种分泌性生产具有天然生物学活性的IFNα的方法，通过培养用所述表达载体转化的微生物经微生物分泌系统产生。本专利技术的另一方面是提供了一种用所述表达载体转化的微生物。本专利技术的再一方面是提供了一种使用所述微生物产生可溶形式的hIFNα的方法，所述hIFNα在氨基末端没有额外的甲硫氨酸残基附着。附图说明图1构建载体pT-IFNα-2a的步骤；图2构建载体pT14SIα-2a的步骤；图3构建载体pT14SSIα-2a的步骤；图4构建载体pT140SSIα-2a-4T22Q的步骤；图5a和5b分别是在重组的细胞系中检测IFNα-2a的表达和表达的IFNα-2a的纯度的SDS-PAGE结果，和检测表达的IFNα-2b的分子量的Western印迹分析结果。专利技术详述根据本专利技术的一方面，提供了一种分泌性产生hIFNα的表达载体，其包含一种编码修饰的耐热肠毒素II信号肽序列(也称为STII突变体)的多核苷酸，和一种连接于其3’末端的编码hIFNα的多核苷酸。用于构建本专利技术的表达载体的编码hIFNα的多核苷酸，可以是任一种编码随机hIFNα亚型的多核苷酸，如天然IFNα-2a(SEQ IDNO1)，IFNα-2b(SEQ ID NO2)，IFNα-1和IFNα-3，而且还可以是重组的多核苷酸，其具有修饰的编码上述IFNα亚型的碱基序列。本专利技术编码修饰的大肠杆菌耐热肠毒素II信号序列的多核苷酸，其连接于编码hIFNα的多核苷酸5’末端本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种分泌性产生人干扰素α（ｈＩＦＮα）的表达载体，包含一种编码修饰的耐热肠毒素Ⅱ信号序列的多核苷酸，和一种连接于其３’末端的编码ｈＩＦＮα的多核苷酸，所述修饰的耐热肠毒素Ⅱ信号序列是通过用其它氨基酸置换具有ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３所示氨基酸序列的大肠杆菌耐热肠毒素Ⅱ信号序列的第４，２０和２２位中的一或多个氨基酸而获得的。

【技术特征摘要】
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【专利技术属性】
技术研发人员：权世昌，郑圣烨，崔基斗，金次纯，裴城敏，李宽淳，
申请(专利权)人：韩美药品工业株式会社，
类型：发明
国别省市：KR[韩国]