表达M1033GI的突变酶GIG138P的基因工程菌株M1033WZ及其构建方法技术

本发明专利技术是一种表达Ｍ１０３３ＧＩ的突变酶ＧＩＧ１３８Ｐ的基因工程菌株Ｍ１０３３ＷＺ及其构建方案，涉及表达葡萄糖异构酶的基因工程菌株以及构建方法。它是以基因敲除和基因置换的同源重组方法，对７号淀粉酶链霉菌Ｍ１０３３的染色体中表达ＧＩ的基因框架进行三轮染色体框架改造从而实现染色体分子突变，即结构基因１３８位点引入ＧＩＧ１３８Ｐ突变位点构建成基因工程菌株。通过基因水平、蛋白水平和菌株传代实验验证，以此方法构建的Ｍ１０３３ＷＺ酶活表达量极其稳定，由其表达的突变体酶ＧＩＧ１３８Ｐ的热稳定性与野生型酶的热稳定性相比有极大提高，已具重组葡萄糖异构酶固相化反应柱的成熟工业生产条件。（*该技术在2022年保护过期，可自由使用*）

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及表达葡萄糖异构酶的基因工程菌株，以及构建该菌株的基因工程方法。中国专利“SM33GI的突变酶GIG138P及一种提高GI热稳定性的突变方案”(95112782.9)给出了对7号淀粉酶链霉菌SM33(也称M1033)的葡萄糖异构酶SM33GI(也称M1033GI)进行突变改造所得的突变酶GIG138P及其突变方案，但未给出可应用于工业生产的稳定且高效表达的基因工程菌株。本专利技术的技术解决方案如下一种表达M1033GI的突变酶GIG138P的基因工程菌株M1033WZ，其染色体中的葡萄糖异构酶GI核苷酸序列的第138位甘氨酸转变为脯氨酸。上述基因工程菌株的构建方法是首先，根据M1033GI的基因序列结构，设计并构建用于GI基因敲除的同源重组载体pTR，利用其变性双链片断实现其与M1033染色体上GI基因的同源重组，获得置换型葡萄糖异构酶缺陷型菌株M1033LJ；其次，构建置换型同源重组质粒pXL，其碱变性质粒转入M1033LJ原生质体，获得插入型同源重组的GI酶活恢复菌株M1033XL；最后，利用平板转接抗性负筛方法获得表达GIG138P突变酶的基因工程菌株M1033WZ。本专利技术的创新之处在于利用基因工程中的基因同源重组技术使M1033GI获得染色体分子改造。链霉菌作为一类重要的工业化生产菌株已有30年以上的生产历史，在工业规模的培养和发酵技术方面积累了相当丰富的经验。在确定构建基因工程菌株M1033WZ的方案时，曾分别尝试进行了链霉菌重组质粒表达菌株和链霉位点特异型整合菌株的构建，但是分别存在重组质粒拷贝数的不稳定性和整合载体结构整合游变变异问题。考虑到重组菌株的稳定性对于工业生产是至关重要的，因此选择染色体分子改造的方法构建基因工程菌株M1033WZ。基因的同源重组技术(homologous recombination)，又称基因打靶(gene targeting)，指外源基因DNA与受体细胞染色体上DNA之间发生重组并整合在预定位点上、从而改变细胞遗传特性的方法。根据重组后靶基因的特征可以分为两种类型一、由于外源基因序列的引入或部分取代，靶基因(即受体细胞染色体之基因)原有结构被破坏，此即为基因破坏或基因敲除(gene disruption or knockout)。二、靶基因的全部序列为新的基因所取代，此即为基因置换(gene replacement)。同源重组技术的特点为①能把外源基因引入受体细胞染色体的DNA特定片段上。在设计合理的情况下，可对受体细胞染色体基因进行精细的改造。②同源重组后新引入的基因随染色体DNA的复制而稳定复制。这一新兴技术已被证明为目前能精确地修饰基因组的最有效方法。从理论上讲，它将使人类能够按照特定的设计思想对极其复杂的细胞基因组结构进行定点、定量的改变，从而定向地改变细胞的遗传结构和特征。因而，这对于目前分子生物学及基因工程领域中的主要研究内容——基因结构和功能、基因表达和调控及人类遗传病的基因治疗等研究均具有极为重要的意义。本专利技术正是这一新兴技术在链霉菌基因工程菌株染色体分子改造中的实际运用。但是，由于同源重组发生的频率很低，因而筛选和富集同源重组的细胞(也就是寻求合适的基因敲除和基因置换重组载体)一直是这个领域中最关键的技术。这项技术的进展使同源重组研究具有了里程碑式的突破而划分为三个发展阶段①自身可作选择标志的特殊基因的同源重组。这是早期阶段采用的方法。1981年，胚胎干细胞系(Embronic stem cells，简称ES细胞)的建立及体外培养技术为同源重组技术打下了细胞水平的坚实的基础。②采用正负选择(positive and negative selection，简称PNS或+/-选择)系统的同源重组。由于在早期阶段采用的特殊基因自身作为标记的方法其应用受到极大的局限，PNS法成为目前广泛采用的方法。③对靶位点进行精细操作的同源重组。虽然通过细胞内的同源重组酶系，可以产生基因原位修正，但是利用DNA修复酶系统缺陷而诱导突变时，由于伴随有无标记突变不能加以试验控制，故不适于精细的基因修正。因此，近年来在+/-选择方法基础发展起来的这项精细操作新技术，不仅使对复杂基因组中特定基因的操作成为可能，而且使对特定基因的特定位点操作也成为可能。在精细操作技术中，其基本策略可分为两大类(1)打了就走策略(hit and run strategy)。这是一种应用插入型载体的两步同源重组策略。(2)标记-交换策略(tag and exchangestrategy)。分别使用被称为标记和突变的两种取代型载体，在标记载体的同源序列中含有标记序列，在突变载体的同源序列中含有突变序列。在链霉菌中最早的同源重组是利用能在链霉菌中自主复制的质粒来完成的。另一种链霉菌重组载体是温度敏感型的噬菌体或质粒。第三种重组载体是非复制型质粒载体pDH5。pDH5是一种大肠杆菌的噬菌粒，它不能在链霉菌中自主复制，但其上含有硫链丝菌素的抗性基因tsr，可用以筛选重组子。由于在链霉菌中单链DNA的同源重组率要比双链DNA高一至两个数量级，所以应用这种载体系统可以大大提高链霉菌中同源重组的成功率。在此基础上进一步发现，通过热变性或碱变性得到的DNA单链用以转化链霉菌，同样可以达到提高重组率的效果。这一发现意味着链霉菌中的同源重组操作不一定要使用特定的重组载体，而可以直接利用含有同源片段的大肠杆菌质粒来进行，从而大大扩展了链霉菌同源重组的应用范围。同时，这一方法也可以解决在使用pDH5载体时单链制备产率低以及在一些链霉菌中存在甲基化修饰障碍的问题，并且使同源重组的操作进一步简化。在链霉菌中进行同源重组时，其主要的问题是为了得到发生交换而丢失了载体序列的重组子，必须从第一步重组所得的重组子的后代中进行大量的筛选工作。从1000-5000个随机克隆中才能筛选得到一个发生了双交换的重组子的情况并不少见。因而在链霉菌中找到一种类似于真核细胞中的胸腺嘧啶激酶(HSV-tk)基因的负选择标记成为近些年来链霉菌同源重组技术研究的发展方向。目前已经有两种基因被用于在链霉菌的基因置换中作为负选择的标记基因。第一种基因是葡萄糖激酶基因(glk)，第二种基因是核糖体蛋白基因(rpsL)，但其筛选量仍然较大。本专利技术在链霉菌基因工程菌株的染色体分子改造中采用了全新的标记-交换-标记-负筛策略，即在基因置换时采取的方法为染色体自身重组结合抗性负筛，解决了链霉菌中基因置换时筛选工作量大的问题，同时避免了上述基因置换过程中复杂的基因操作。也就是说，本专利技术根据M1033GI的基因序列，设计并构建了合理的基因敲除和基因置换重组载体，通过原生质体转化，在M1033GI染色体中先后实现GI基因的标记、敲除和置换。通过这三轮同源重组过程，在M1033GI染色体的GI基因138位点引入突变位点G138P，从而获得基因工程菌株M1033WZ。对基因工程菌株M1033WZ的分子验证包括聚合酶链式反应扩增、核苷酸序列测定和杂交(Southern)等，蛋白验证包括蛋白电泳(SDS-PAGE)、GI分离纯化、活性测定、热稳定性检测等。分子实验结果表明所获得的基因工程菌株M1033WZ染色体的GI基因138位点已引入突变位点G1本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种表达Ｍ１０３３ＧＩ的突变酶ＧＩＧ１３８Ｐ的基因工程菌株Ｍ１０３３ＷＺ，其特征在于染色体中的葡萄糖异构酶ＧＩ核苷酸序列的第１３８位甘氨酸转变为脯氨酸。

【技术特征摘要】
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【专利技术属性】
技术研发人员：徐冲，滕脉坤，牛立文，朱国萍，伍传金，杨永辉，张颖，廖军，王庆华，龚为民，朱忠良，王玉珍，
申请(专利权)人：安徽中科大易元生物技术有限公司，
类型：发明
国别省市：34[中国|安徽]