苯丙咪唑抗性基因在木霉菌中的应用制造技术

苯丙咪唑抗性基因在木霉菌中的应用，一种苯丙咪唑抗性基因在木霉菌中的应用技术。在微生物农药的研发过程中，其技术轨迹由最早的大规模的野生菌株的筛选，发展到采用物理及化学方法定向诱变技术，进而利用选择压力的调节来达到筛选理想菌株方法的使用。但由于生物防治菌对化学杀菌剂普遍敏感，严重地限制了它们广泛应用。本发明专利技术提供了一种苯丙咪唑抗性基因在木霉菌中的应用技术。通过采用基因工程手段改造微生物菌株，使其既具有防病害能力，又能够提高对化学杀菌剂的抗性，使生物防治与化学防治的综合体系得以建立。（*该技术在2022年保护过期，可自由使用*）

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及一种苯丙咪唑抗性基因在木霉菌中的应用技术。
技术介绍
在植物病害生物防治领域中微生物所发挥的作用越来越大了。在国外，美国成功的将Bt毒素基因转移到假单胞细菌(Pf)中，构件出转基因工程细菌；澳大利亚科学家用生物技术手段，将放线土壤杆菌(K84)改良成具有持久效力的K1026菌株。在国内，利用现代基因工程技术建立了苏云金芽胞杆菌(Bt)、荧光假单胞菌(Pf)、枯草芽孢杆菌(Bs)等细菌的遗传转化体系，创造出一套适合我国国情的菌株分离筛选、基因鉴定、克隆等研究方法，并在真菌的生物改良上取得了重大突破。微生物农药的研究与生产逐渐成为生物防治的支柱产业。而在微生物农药的研发过程中，其技术轨迹由最早的大规模的野生菌株的筛选，发展到采用物理及化学方法定向诱变技术，进而利用选择压力的调节来达到筛选理想菌株方法的使用。但由于生物防治菌对化学杀菌剂普遍敏感，严重地限制了它们广泛应用。为了克服杀菌剂与生物防治菌使用之间的矛盾，人们试图采用基因工程手段改造微生物菌株，使其既具有防病害能力，又能够提高对化学杀菌剂的抗性，使生物防治与化学防治的综合体系得以建立。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种苯丙咪唑抗性基因在木霉菌中的应用，采用原生质体转化技术，利用酵母的微管蛋白的突变基因，成功的建立起多菌灵抗性基因在木霉、毛壳菌中的转化体系，攻克了木霉和毛壳菌对化学农药非常敏感这一重大难题，使综合防治思想的真正实现成为可能。进行这种应用的主要内容包括1.木霉菌菌株(Trichoderma harzianum)由泰国农业大学提供。质粒pBR129含有多菌灵抗性基因(Ben)，来自美国斯坦福大学，与E.coli DH5a(大肠杆菌)木霉中扩增和保存。2.菌体的培养PDA固体培养基和PD液体培养基分别用于木霉的孢子培养和菌丝培养。PDA固体培养基组成马铃薯 200g蔗糖或葡萄糖20g琼脂15-20g水 1000mlPh 自然PD液体培养基组成PDA中去除琼脂把马铃薯去皮，切成块煮沸半小时，然后用纱布过滤，再加糖琼脂，融化后加水至1000ml。1.05千克/平方厘米，121.3℃灭菌20分钟。培养条件37℃温浴3天3.木霉菌转化前对多菌灵敏感性测定将木霉分别培养在含多菌灵浓度为0，0.1，0.2，0.4，0.6，0.8μg/ml的培养基中，测定对其菌丝生长的抑制(处理菌落半径/对照菌落半径)，结果表明，这些木霉菌在1.0μg/ml多菌灵的浓度下均不能生长。4.感受态原生质体的制备经DM(1.2mol/L山梨醇，10mol/L Tris缓冲液，Ph＝7)清洗，将在PD液体培养基中培养的木霉菌丝经5,000r/min离心5min，弃上清收集沉淀。将沉淀悬浮于含0.8％Novozym酶234的DM中，室温震荡作用3h，经纱布过滤除去细胞碎片，在经5,000r/min离心5min，沉淀用DM液和TM液(1.0mol/L山梨醇，10mmol/LTris，pH＝7.5，20mmol/L CaCl2)转化液各洗涤一次，然后将沉淀悬浮于TM转化液中。5.转化在200μlTM原生质体(2×106)液中加入100ul含50μg的pBR129质粒的TE(Tris EDTA乙二胺四乙酸)，置冰浴中作用10min，再加入1mlPEG(聚乙二醇4000)TM液，在室温作用10min，然后再加入4ml RM(1.2mol/L山梨醇，10mmol/L Tris，pH＝7.5，0.1％K2HPO4，0.05％MgSO4，0,3％NaNO3)液进行稀释，按每分2×105原生质体的数量，混合于10ml溶化的RA(1.2mol/L山梨醇，10mmol/L Tris，pH7.5，0.1％K2HPO4，0.3％NaNO3，0.7％琼脂)中，在平皿中27℃下分别培养16，18，24h。6.筛选分别培养16，18，24h后，在平皿中加入10ml含多菌灵(江阴农药厂生产的可湿性粉剂)(10μg/ml)的RA，在27℃下继续培养，转化时不加质粒的对照组处理无菌落出现，加入质粒的处理出现了抗多菌灵的球毛壳菌株，继代培养发现，这些菌株可在高于1.0μg/ml的多菌灵处理下正常生长，挑选出成活的菌株打孔取样作进一步生物测定。7.转化子生物测定将转化子在含0，0.5，5，50，100，500，1000μg/ml多菌灵处理条件下培养，测定转化子对多菌灵的抗性水平，结果显示，将多菌灵抗性基因转化到木霉中，使之能够在1000μg/ml多菌灵处理条件下正常生长，而原菌株在1.0μg/ml多菌灵浓度下即不能生长，抗药性比原来增加1000倍。同时，将转化子在不含多菌灵的培养基上培养十代(培养条件同步骤2)，然后分别再在含有0，0.5，5，50，100，500，1000μg/ml多菌灵处理条件下培养，检验转化子的抗药稳定性，结果显示，抗药性稳定不变。本专利技术的优点在于微生物菌株在植物病害的生物防治中具有防治效果好、无污染、对人畜安全、无残留、特异性强以及保持生态平衡等优点，除此之外，本菌株还具有如下优良性状1.菌株整合了来自酿酒酵母(Saccharomyces cervisiae)β-微观蛋白的突变基因，突变位点为241位的精氨酸变成组氨酸，这一变异使其具有更强的抗药性；2.对多菌灵敏感性降低实验证明，转化前菌株在1.0μg/mg的多菌灵液体处理下抑制率为100％，转化后可以在1000μg/mg的多菌灵处理条件下正常生长，抗药性增加1000倍；这种抗药性的增强效果是十分显著的，其机理是改变了多菌灵对真菌的作用位点，使多菌灵不能作用于真菌，从而克服了真菌对多菌灵药物的敏感性，使化学防治与生物防治综合防治体系的建立成为可能，从而达到更理想的防治病害的效果；3.实验证明，该基因工程菌株在非选择压力下连续培养十代，抗药稳定性不变，转化率为6-7个转化子/μgDNA；该性状说明其目的基因表达非常稳定，不需要反复进行基因转化，有利于应用这一菌株于植物病害的综合防治的实践中；4.与原菌在培养条件相同的情况下，该菌株生长速度快，菌丝粗大，子囊壳黑色，与原菌株呈现出不同的生长状况。这一特性缩短了育菌周期，使其产业化更加方便、容易。实施例苯丙咪唑抗性基因在木霉菌中的应用，其培养过程、转化、筛选及其应用后的产物的性能监测、已及带来的特点等等已经在内容部分叙述，不再复述。权利要求1.一种苯丙咪唑抗性基因在木霉菌中的应用。全文摘要苯丙咪唑抗性基因在木霉菌中的应用，一种苯丙咪唑抗性基因在木霉菌中的应用技术。在微生物农药的研发过程中，其技术轨迹由最早的大规模的野生菌株的筛选，发展到采用物理及化学方法定向诱变技术，进而利用选择压力的调节来达到筛选理想菌株方法的使用。但由于生物防治菌对化学杀菌剂普遍敏感，严重地限制了它们广泛应用。本专利技术提供了一种苯丙咪唑抗性基因在木霉菌中的应用技术。通过采用基因工程手段改造微生物菌株，使其既具有防病害能力，又能够提高对化学杀菌剂的抗性，使生物防治与化学防治的综合体系得以建立。文档编号A01N63/00GK1418947SQ0214480公开日2003年5月21日 申请日期2002年11月10日 优先权日2002年11月10日专利技术者杨谦 申请人:杨谦本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种苯丙咪唑抗性基因在木霉菌中的应用。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：杨谦，
申请(专利权)人：杨谦，
类型：发明
国别省市：93[中国|哈尔滨]