人瘦素蛋白在鸡蛋蛋清中的特异表达制造技术

技术编号:1725074 阅读:413 留言:0更新日期:2012-04-11 18:40
本发明专利技术涉及一种人瘦素蛋白(leptin)在鸡蛋蛋清中特异表达,属于动物生物反应器或基因工程技术领域。本发明专利技术构建了可在鸡蛋蛋清中特异表达人瘦素蛋白的表达载体pXABOBSV40;利用脂质体-精子载体通过人工授精获得带有外源人瘦素蛋白基因的转基因鸡。检测结果显示,外源基因导入的阳性率达60%以上;24%的后代转基因阳性鸡所产鸡蛋蛋清中表达了重组人瘦素蛋白,该重组人瘦素蛋白具有与天然人瘦素蛋白有相同的立体结构,表达水平达到每升蛋清30毫克。(*该技术在2022年保护过期,可自由使用*)

【技术实现步骤摘要】

本专利
属于动物生物反应器或基因工程
具体涉及由自主设计和克隆各类适合于人瘦素蛋白在鸡蛋蛋清中特异表达的表达元件,并克隆为人瘦素蛋白输卵管组织特异性表达的表达载体pXABOBSV40,利用脂质体-精子双载体系统导入外源基因获得转基因鸡,最终在鸡蛋蛋清中特异表达了有正确立体结构的重组人瘦素蛋白,为利用鸡输卵管(鸡蛋蛋清)生物反应器生产有药用、保健及生化试剂作用的蛋白质奠定基础。人瘦素蛋白(leptin)是1994年发现的一个由167个氨基酸组成的小蛋白,由脂肪组织产生,是肥胖相关的信号。脂肪组织的反馈信号作用到脑中心,控制饮食行为和活动(代谢和运动),是ob(obese)基因的产物。脂肪组织产生的瘦素蛋白经血液运输到脑,与下丘脑的受体作用后通过控制饮食摄入和能量消耗来控制哺乳动物的体重(25-55岁)。实验证明注射瘦素蛋白可以将肥胖小鼠的体重恢复正常,被认为是最具潜力的减肥药物之一。如能在鸡蛋蛋清中实现特异性高表达,将具有重大理论意义和实际应用价值。本专利技术提出的在鸡蛋蛋清中特异表达外源基因人瘦素蛋白的方法,包括构建一种可在鸡蛋蛋清(鸡输卵管组织)特异表达人瘦素蛋白的表达载体pXABOBSV40,并通过脂质体-精子双载体法获得转基因鸡,该转基因后代鸡所产鸡蛋的蛋清中有可表达重组人瘦素蛋白,所表达的重组人瘦素蛋白具有天然的立体结构,表达水平达到30毫克/升蛋清。本专利技术中,可在鸡蛋蛋清(鸡输卵管组织)特异表达人瘦素蛋白的表达载体pXABOBSV40,具体克隆流程见附图说明图1所示。该载体以pSK为出发质粒,基本构成元件包括X(Mar)元件(300-500bp)、卵清蛋白基因的启动子A片段(1.45kb)、卵清蛋白基因的第一个内含子B片段(1.55kb)、ob基因(504bp)和SV40的大T抗原的转录终止子或卵清蛋白C片段作为转录终止子,以上各元件分别通过PCR反应获得,以特定限制性酶切位点克隆为输卵管组织特异表达载体pXABOBSV40。本专利技术中,通过脂质体—精子双载体法获得转基因鸡的步骤如下由鸡蛋蛋黄纯化卵磷脂;构建的表达载体pXABOBSV40用Sac I酶切线性化,加入质粒DNA量1/10-1/20的鱼精蛋白,超声波法制备脂质体;人工采集雄鸡精子,用37℃-39℃预温的KR溶液洗精液,离心收集精子后以37℃-39℃预温的KR溶液悬浮精子,加入包埋有DNA的脂质体,混匀后37℃-39℃保温20-30分钟,立即进行人工授精,授精的精子数量控制在一只正常采精公鸡采出的精液经上述处理后与20只雌鸡进行人工授精,4天后同样方法强化一次人工授精,收集鸡蛋集中孵化21天得“转基因”后代鸡。本专利技术中,各表达元件的克隆,进一步介绍如下根据Genbank公布的前述各表达元件的序列,设计特异引物进行PCR扩增,并引入克隆用双酶切位点,X元件5’端和3’端的酶切位点为分别是Sac I和Not I;A片段5’和3’端的酶切位点分别为Not I和HindIII;B片段5’和3’两端的酶切位点分别为HindIII和Nco I;ob基因通过反转录获得cDNA,PCR获得双链cDNA,其5’和3’两端的酶切位点为Noc I和Xho I;SV40的polyA或卵清蛋白C片段转录终止子的5’和3’两端的酶切位点分别是Xho I和Kpn I。利用质粒pSK上的多克隆酶切位点一步一步把以上元件克隆串联起来组成鸡输卵管组织特异表达载体pXABOBSV40,克隆后的表达质粒以PCR和酶切鉴定。本专利技术中,获得转基因鸡的步骤进一步描述如下大规模制备表达载体pXABOBSV40,用SacI限制性内切酶进行线性化处理,纯化后与1/10-1/20量的鱼精蛋白混合,用于脂质体包埋;从鸡蛋蛋黄中通过丙酮-乙醚反复抽提卵磷脂,中性氧化铝层析纯化卵磷脂,纯化的卵磷脂加入KR溶液(120mM NaCl,20mM KCl,5mM CaCl2,2mM MgSO4,30mMNaHCO3),超声波悬浮,加入待包埋的表达载体混合,加入与卵磷脂等量的用KR溶液溶解的胆酸钠,对PBS透析获得包埋了表达载体的脂质体,脂质体的大小通过控制组份比例控制在φ100-200nm左右;采集新鲜精液,用37℃-39℃预温的KR溶液洗精液,离心收集精子后用KR溶液悬浮精子,加入包埋有表达载体的脂质体,混匀后37℃-39℃保温20-30分钟,立即进行人工授精,授精的精子数量控制在一只正常采精公鸡采出的精液经上述处理后与20只雌鸡进行人工授精。4天后重复上述人工授精一次,收集的鸡蛋集中在全自动控制的孵化箱内孵化21天得“转基因”后代鸡。本专利技术进一步对转基因鸡的后代鸡的外源基因及所产鸡蛋蛋清中的外源基因表达进行了检测,其方法和结果如下对后代“转基因鸡”一周龄开始静脉采血,按血细胞总DNA抽提方法抽提总DNA,设计ob基因PCR检测特异引物,以无DNA模板的无菌水和非转基因鸡血细胞DNA为阴性对照,pXABOBSV40为阳性对照,按人ob基因特异序列,设计并合成特异扩增引物,PCR反应检测小鸡总DNA中的外源基因,检测结果显示60%以上的后代鸡带有导入的外源基因pXABOBSV40。PCR检测的琼脂糖凝胶电泳结果见图2。对PCR反应为阳性的鸡所产鸡蛋蛋清蛋白进行Western bloting分析,收集PCR反应阳性鸡所产鸡蛋鸡蛋,PBS抽提蛋清蛋白。以自制的多抗(人ob基因克隆到pET41a中,在大肠杆菌B21中的表达,表达产物—融合人瘦素蛋白经聚丙烯酰胺凝胶电泳分离,割胶带取蛋白免疫兔子,获得多克隆抗体)作为一抗进行Western blotting分析,以非转基因鸡的鸡蛋蛋清蛋白作为阴性对照,检测鸡蛋蛋清蛋白中重组人瘦素蛋白的表达情况(结果见图3),阳性反应结果显示有24%的PCR反应阳性鸡所产的鸡蛋蛋清中表达了重组人瘦素蛋白。用购自Biomol Research Laboratories(USA)的ELISA试剂盒,对个别Western blot阳性鸡的鸡蛋蛋清中的Leptin进行了定量分析,该试剂盒产用“三明治”原理,在96孔板上预包埋了抗人Leptin的单克隆抗体,当样品中的Leptin与该单抗结合后,再用结合位点不同于第一个单克隆抗体的第二个单克隆抗体进行结合和显色,因此特异性高,而且所反映的应该是拥有完整天然立体结构的Leptin的量。反应结果表明转基因鸡鸡蛋蛋清中确实表达了重组人瘦素蛋白,所表达的重组人瘦素蛋白与天然人瘦素蛋白有相同的立体结构,定量分析显示,转基因鸡鸡蛋蛋清中表达重组人瘦素蛋白的表达水平为30mg/L蛋清。本专利技术的优点(1)构建了人瘦素蛋白基因能特异性在鸡输卵管中(最终可分泌到蛋清中)表达的表达载体。其中利用了一系列的分子遗传学原理和分子生物学技术,在系统分析蛋清蛋白表达的分子机制后,根据现代真核生物分子遗传学的特点,设计和克隆表达载体所需的各种元件,构建了适于蛋清中特异表达的重组人瘦素蛋白表达载体。(2)提供了有效的转基因技术。将脂质体用于包埋外源表达载体。包埋后带有外源表达载体的脂质体与精子混合后对母鸡人工授精,利用精卵受精过程把外源基因有效转染到受精卵中。大规模转基因鸡试验显示,本专利技术转基因方法的外源基因在转基因后代鸡中的有效率达到6本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种在鸡蛋蛋清中特异表达外源基因人瘦素蛋白的方法,其特征在于构建一种可在鸡蛋蛋清特异表达人瘦素蛋白的表达载体pXABOBSV40,并通过脂质体-精子双载体法获得转基因鸡,该转基因后代鸡所产鸡蛋的蛋清中有转基因鸡可表达重组人瘦素蛋白,所表达的重组人瘦素蛋白具有天然的立体结构,表达水平达到30毫克/升蛋清。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员:王维荣严华祥黄伟达杨长锁谢承光闵太善朱蕾张永芳陈璎夏冠军李明王亿军
申请(专利权)人:上海复旦新杨生物科技有限责任公司复旦大学
类型:发明
国别省市:31[中国|上海]

网友询问留言 已有0条评论
  • 还没有人留言评论。发表了对其他浏览者有用的留言会获得科技券。

1
相关领域技术
  • 暂无相关专利