调节腈水解酶选择性的方法,用此方法获得的腈水解酶及其用途技术

本发明专利技术涉及一种具有调节选择性的修饰的腈水解酶，其特征在于，它包含与不同于原来的氨基酸残基的１６２位氨基酸残基。（*该技术在2020年保护过期，可自由使用*）

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】,用此方法获得的腈水解酶及其用途的制作方法
本专利技术涉及选择性增强的新型腈水解酶，获得此酶的方法和所述腈水解酶的用途。腈水解酶催化腈基水解为相应的羧酸和氨离子的酶是腈水解酶(Fable，有机化学中的生物转化(Biotransformations in Organic Chemistry)，SpringerVerlag，柏林，海德堡，1992，ISBN3-540-55762-8)。但是，这种最终导致腈基水解的将腈基转化为相应羧酸的生物转化也可在两步反应中进行，第一步包括用腈水解酶将腈转化为酰胺的生物转化，第二步包括用酰胺酶水解酰胺而获得相应羧酸。腈水解酶最先在植物中被发现(Thimann和Mahadevan，1964，Arch.Biochem.Biophys.105；133-141)并然后在许多土壤微生物群落(Kobayashi和Shimizu，1994，FEMS Microbiology letters 120；217-224)；假单孢菌属，诺卡菌属，节杆菌属，镰孢菌属，Rhodoccocus，克雷伯氏杆菌属和产碱菌属中分离到它。最近在嗜热菌中已鉴定出腈水解酶(Cramp等，1997，Microbiology，143，2313-2320)。腈水解酶有不同的底物特异性，但根据其特异性它可分为三类脂族腈特异性的腈水解酶，芳香腈特异性的腈水解酶或芳基乙腈特异性的腈水解酶(Kobayashi等，1993，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90；247-251；Kobayashi和shimizu，1994，前已提及；Lévy-Schil等，1995，Gene 161；15-20；Layh等，J.Mol.Catal B；Enzymatic5；467-474)。因为许多合成工艺涉及腈基的水解，腈水解酶在生物催化中是有价值的(Yamamoto等，1991，Appl.Environ.Micro.57；3028-3032；Fable，有机化学中的生物转化，第二版，Springer Verlag，柏林，1995；Lévy-Schil等，1995，Gene 161；15-20；Cowan等，1998，Extremophiles 2；207-216)；己二腈转化为腈基戊酸或己二酸，烟酸的合成，对氨基苯甲酸(凝血酸)的合成，扁桃腈的对映体选择性水解。尤其是粪产碱菌ATCC8750中的腈水解酶(本申请中称为NitB)，Comamonas Testosteroni中的腈水解酶(本申请中称为NitA)可用于获得甲硫氨酸的羟基类似物(FR9411301，WO9609403，FR9613077)。腈水解酶有不同程度相似性排列的一级结构，从大约30％开始，对比几种腈水解酶的序列揭示几个残基的保守性，包括NitB腈水解酶第163位的半胱氨酸残基。这个残基参与了腈水解酶反应的机制(Kabayashi等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90；241-251)。对于本专利技术而言，参考序列是NitB序列，所有特定氨基酸位点的定义和作用均以NitB一级序列为对照。所附的附图说明图1列出了至今为止以被描述的14种腈水解酶的序列，以NitB为参照作对比，包括Arabidopsis thaliana的p_Athalia1-4(SwissProt保藏号P32961，P32962，P46010，P46011)Nicotiana tabacum的p_Tobacco1和2(GeneBank保藏号D63331，D83078)，Rhodococcus rhodocrous J1的b_RhodocJ1(GeneBank保藏号D11425)，Rhodococcus rhodocrous PA34的b_RrhodocPA3(GeneBank保藏号E09026)，Gordona terrae的b_Gterrae(GeneBank保藏号E12616)，Rhodococcus rhodocrous K22的b_RhodocK22(GeneBank保藏号D12583)，Klebsiella ozaenae的b_Kozaenae(SwissProt保藏号P100450)，Camamonasteatosteroni NI1和NitA的b_CtestosNI1(GeneBank保藏号L32589)，Alacaligenes faecalis JM3或NitB的b_Afaecalis(Swissport保藏号P20960)。图中给出了NitB序列的氨基酸(编号在底部)，还有带编号的共有序列(编号在顶部)。根据本申请中的约定，其他腈水解酶的残基根据这个半胱氨酸残基编号，并根据NitB腈水解酶的序列作为参照序列。基于这样的排列，或此排列中的任一腈水解酶的序列，本领域的技术人员运用已给出其定位和性质的NitB氨基酸的定义可以容易地识别出另一个腈水解酶序列中相应氨基酸的位点。选择性问题腈水解酶选择性被定义为不带由腈水解酶催化的腈水解所产生的羧基的化合物的百分数。这的数字相对而言是较小的，但在某些腈水解酶和底物中是明显的。因此，在由假单孢荧光菌DSM7155的腈水解酶催化的2-甲氧基扁桃腈水解为2-甲氧基扁桃酸的反应同时有副产物2-甲氧基扁桃酰胺产生(Layh等，1998，前已提及)。与之相似，本申请的实施例中，在由Comamonas testosteroni NI1的NitA腈水解酶催化的2-羟基-4-甲硫基-丁腈(HMTBN)水解伴随着副产物2-羟基-4-甲硫基-丁酰胺(HMTBM)的产生。若使用这样的酶/底物配对的生物催化工艺，腈水解酶对于其底物缺乏选择性会导致酰胺副产物的产生，这意味着工艺的产率的丢失。此产率的丢失会有相当大的经济上的影响。另外，这种选择性的缺乏导致存在的酰胺污染反应产物。从而羧酸的纯化是必要的，并且，同样的，这对工艺带来了经济上的影响。因此，对于一指定的底物，缺乏腈水解酶的选择性为开发使用这种酶和这一底物的生物催化工艺带来了障碍。如果酶选择性的下降伴随着此酶对它的底物的催化活力上升，那么这种下降也可能是我们所需要的。特别是在除污染的方法情况下，其中需要寻找一种具有最大比活力的酶来快速降解有毒分子。在这种情况下，酶催化反应所得的产物的性质相对于底物降解的速率而言就不重要了。因此，特别重要的是能调节腈水解酶的选择性，既增强该选择性，又能产生上述的降低选择性。酶的强化酶的直接进化包括了通过对有增强功能的酶突变体反复筛选，获取有特定功能的酶。(Arnold和Volkov，1999，Current Opinion in ChemicalBiology 354-59；Kuchner和Arnold，1997，Tibtech 15523-530)。这些突变体是通过对基因编码待研究的酶的一些突变技术得到的(skandalis等，1997，Chemistry & Biology 48889-898；Crameri等，1998，Nature 391288-291)化学突变(Singer和Fraenkel-Conrat，1969，Prog.Nucl.Acid Res.Mol.Biol.9；1-29)，易错聚合酶链式反应的突变(Leung等，本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种具有调节的选择性的修饰的腈水解酶，其特征在于，它包括，在１６２位，一个氨基酸残基与原先的氨基酸残基不同。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】...

【专利技术属性】
技术研发人员：J彼尔阿德，O法威布勒，C茹尔达，
申请(专利权)人：阿方蒂动物营养素股份有限公司，
类型：发明
国别省市：FR[法国]