一种提高黄芪毛状根中黄芪多糖的方法技术

技术编号:1725019 阅读:171 留言:0更新日期:2012-04-11 18:40
一种提高黄芪毛状根中黄芪多糖的方法,其特征在于该方法是通过基因工程方法发根农杆菌介导,将在强启动子和强终止子调控下的葡萄糖苷转移酶基因导入黄芪毛状根中。(*该技术在2022年保护过期,可自由使用*)

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属基因工程
具体涉及。本专利技术提供了,该方法是通过基因工程方法发根农杆菌介导,将在强启动子和强终止子调控下的葡萄糖苷转移酶(又称ADP、UDP,葡萄糖苷转移酶)基因导入黄芪毛状根中。PCR和Southern杂交表明此基因已经整合到毛状根基因组中并且以单拷贝的形式存在。转基因毛状根的生长量及葡萄糖苷转移酶酶活性均比对照显著提高,并且多糖产量亦得到显著提高(高于对照68.8%,其中最高幅度为127%)。表1 转葡萄糖苷转移酶基因黄芪毛状根生长量、多糖含量、葡萄糖苷转移酶活性与多糖产量和对照组比较表组别干重 多糖含量 GBSS活性多糖产量(g) (mg/g毛状根) (U) (mg)对照1.08±0.2219.38±0.92 1.60±0.04 20.87±3.16转基因毛状根1.66±0.18**21.29±4.38 37.01±16.20**35.22±7.06**注对照为普通毛状根,即用发根农杆菌直接诱导未携带外源基因的毛状根另附PCR鉴定图和液体培养的转基因黄芪毛状根生长图通过转基因(葡萄糖苷转移酶)方法可以显著提高黄芪毛状根中有效成分黄芪多糖的含量,从而为工业化生产提供了高产的原材料。以发根农杆菌诱导生成的黄芪毛状根具有生长迅速、遗传稳定、易于扩大培养等优点,如果能够增加其中黄芪多糖的含量,将有利于工业化生产,解决品质退化问题。本技术应用基因工程方法,显著提高了黄芪毛状根中的黄芪多糖的含量。实施例2cDNA的合成操作程序I.按照下表配制反应混合液反应液 反应量cDNA合成缓冲液*4uldNTP(10mM) 2ulOlig(dT)(12.5uM)1ulmRNA0.2-2ugAMV(20U/ul) 1ulddH2O --Total 20ul *cDNA合成缓冲液(250mM Tris-HCl,40mM MgCl2,150mMKCl,5mM DTT,pH8.5)II.混匀后,55℃保温60min,65℃保温10min,灭活AMV,瞬间离心,将溶液集于离心管底部。实施例3一步法提取膜荚黄芪(Astragalus membranaceus Bge.)中的总RNA,经逆转录为cDNA第一链,用PCR方法克隆淀粉粒结合淀粉合成酶(葡萄糖苷转移酶,又称ADP(UGP)葡萄糖苷转移酶)表达框序列,使用引物序列如下正向引物P15’-CCTCTAGATGTTGCTCCTTACTGCTCTCT C-3’,逆向引物P25’-CCGAGCTCTGTG GGCTACAAAATCCTTCTG-3’。PCR循环条件如下94℃预变性5min;然后94℃变性30sec,55℃复性30sec,72℃延伸1.5min,共30个循环;最后72℃延伸7min结束反应。扩增出的片段约2.0kb,经0.8%凝胶电泳纯化后测序鉴定序列的正确性。然后载入载体质粒pBI121获得质粒pBI-葡萄糖苷转移酶,并转入大肠杆菌DH5α。重组后的葡萄糖苷转移酶基因获得强启动子CaMV和强终止子NOS-ter。实施例4将含质粒pBI-葡萄糖苷转移酶的大肠杆菌和大肠杆菌pRK2013及发根农杆菌LBA9402进行共培养(三亲杂交)筛选抗性农杆菌诱导黄芪幼苗,获得转基因黄芪毛状根。同时,用未转基因的农杆菌直接诱导黄芪幼苗,获得的毛状根作为对照。实施例5三亲杂交法 LBA9402、pRK2013和pBI-葡萄糖苷转移酶三种细菌分别在YMB(Rif)、LB、LB(Kan)培养基上培养,挑单菌落分别用相应的液体培养基振荡培养12小时,将其稀释至浓度相近,混合后滴于无菌滤片上,然后在YMB培养平板上培养18小时。用1mM MgSO4冲洗滤片,洗液在YMB(Rif,Kan)平板上涂布。三天后可见到菌落出现。挑单菌落进行分子鉴定。实施例6YMB培养基组成(g/L)甘露醇 10酵母提取物 0.4NaCl 0.1MgSO47H2O 0.2K2HPO40.5调pH至7.2后高压灭菌实施例7LB培养基组成(g/L)胰化蛋白胨 10酵母提取物 5NaCl 10调pH至7.0后高压灭菌实施例8黄芪毛状根的继代培养按照胡之璧等提供的方法诱导和培养膜荚黄芪毛状根,在250ml的三角瓶中加入100ml MS培养基,接种0.1g(鲜重),25℃黑暗条件下摇床(80rpm)培养,共培养35天。实施例9生长量的测定每5天取样一次,每次取样5瓶,冷冻干燥后称重,以干重表示毛状根的生长量。实施例10将不同株系的毛状根分别在MS液体培养基中扩大培养,选用的培养基参照标准配方,但其中的硝酸铵成分因为抑制毛状根的生长,因而用1%水解酪蛋白代替作为氮源。去除了其中的激素成分,采用3%的蔗糖作为碳源。暗培养14天后,分别测定生长量、多糖含量和葡萄糖苷转移酶酶活性。其中,以干重作为生长量指标;多糖的提取和测定参见Shan等;葡萄糖苷转移酶酶活性的测定参见Fujita等提供的方法。实施例11MS培养基组成(mg/L)大量元素KNO31900CaCl2·2H20 440MgSO4·7H2O 370KH2PO4170微量元素KI 0.83 H3BO36.2MnSO4.4H2O 22.3ZnSO4.7H2O 8.6Na2MoO4.2H2O 0.25CuSO4·5H2O0.025CoCl2·6H2O0.025Fe盐Na2EDTA.2H2O 37.3FeSO4.7H2O 27.8有机元素肌醇 100烟酸 0.5盐酸吡哆醇0.5盐酸硫酸胺素 0.4甘氨酸2.0实施例12总DNA的提取采用CTAB方法,取材料0.5g置于陶瓷研钵中,加入液氮快速研磨至细粉末状,加入500μl 2×CTAB(2%CTAB,0.1M Tris-HCl pH8.0,0.02M EDTA,1.4M NaCl,2%β-Mercaptoethanol)提取缓冲液,混匀,60℃水浴30min后,加500μl水饱和苯酚∶氯仿∶异戊醇(25∶24∶1)反复混匀,10000rpm离心10min。吸取上清液至一新的Eppendorf管中,加入1/10体积的3M NaAc和等体积的异丙醇,混匀后于-20℃静置20min,10000rpm离心10min沉淀DNA,弃上清液,沉淀依次用70%乙醇和无水乙醇漂洗,自然干燥后溶于含RNase的ddH2O中,分光光度法和凝胶电泳检测浓度和纯度,将每管DNA浓度调至50-100ng/μl,4℃保存备用。实施例13葡萄糖苷转移酶的提取取5g毛状根材料,加1ml提取缓冲液(pH6.8,55mM Tris-HCl,2.3%SDS,5%2-mercaptoethanol,10%甘油),冰上研磨,匀浆液过滤,混悬液13000g离心1min。沉淀经提取液洗涤3次后,重蒸水洗涤2次。再用丙酮洗涤2次,然后减压蒸干,保存于-20℃待用。实施例14葡萄糖苷转移酶活性测定取提取的葡萄糖苷转移酶0.2-3mg,加入200μl反应缓冲液(100mM甘氨酰-NaOH,pH8.5,100mM KCl,2.5mM MgCl2,0.5mMEDTA,1mM ADP-葡萄糖),混匀后35℃保温30min,4℃离心5min终止反应。取150μl,在以下缓冲液中反应,1本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员:吴晓俊胡之璧刘涤赵淑娟
申请(专利权)人:上海中医药大学
类型:发明
国别省市:

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