表达人类血管紧张素II受体I反义基因的重组腺相关病毒及其制备方法技术

一种表达人类血管紧张素ＩＩ受体Ｉ反义基因的重组腺相关病毒（ｒＡＡＶ），它适用于高血压、心力衰竭、肾脏疾病及其他相关疾病的基因治疗，该载体系统包括包装质粒ｐＸＸ＃－［２］，辅助质粒ｐＸＸ＃－［６］，真核表达载体ｐＸＸＵＦ＃－［３］内插入了人类血管紧张素ＩＩ受体Ｉ反义基因编码序列。该重组腺相关病毒由天然状态的腺相关病毒经分子生物学方法人工剪切、修饰和加工，再经分子生物学方法包装复制，并经纯化而成。（*该技术在2022年保护过期，可自由使用*）

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及生物材料领域。具体地说是一种将人类血管紧张素II受体I反义基因(AT1-AS)与重组腺相关病毒载体重组构建，并获得可以满足治疗要求的滴度。
技术介绍
高血压是一种多因素影响，多基因起源的慢性疾病。应用传统药物能够有效控制，但也存在一些缺点。首先，高血压病人在就诊时许多已有靶器官损害，临床上所用的有些药物不能逆转高血压的合并症。其次，由于药物的副作用，病人长期服药的依从性受到很大的影响，而且轻至中度的高血压病人多无症状，病人往往认为服药是非必须的，很不方便，影响疾病的治疗。由于该病是病人每天需用药1-3次，而且可能是联合使用多种药物，并且终身服用才能达到效果，更影响病人依从性，而且药物价格昂贵使许多病人难以坚持治疗。而从基因水平上对高血压的致病基因进行校正，将为最终治愈高血压带来希望。由于人类RAS在高血压发病中的作用比较明确，在人体中分布广泛，而且临床上作用于RAS的药物能从多种水平发挥抗高血压的作用，因此反义抑制RAS能产生降血压的效应，这已在动物实验中得到证实。以病毒为载体介导的血管紧张素II受体I反义基因注入自发性高血压大鼠体内，能够长期使血压下降，同时能够逆转高血压引起的病理生理改变。在幼年自发性高血压大鼠应用血管紧张素II受体I反义基因后，还能阻止高血压的进展。应用于其它动物模型，也充分证明血管紧张素II受体I反义基因治疗的可靠性，有效性。同时基因治疗也具有药物所不具备的优越性。但以往的病毒载体，由于存在免疫源性，与基因组的非特异性整合，转基因范围窄等原因，限制了基因治疗的应用。
技术实现思路
本专利技术所使用的重组腺相关病毒载体它可以携带基因转染分裂期和非分裂期细胞(即具有广泛的转基因范围)、无副作用(无免疫源性)、感染效率高、能驱动基因在体内长期表达，而且成功地解决了无腺病毒污染的体外大量复制问题。为了能使高血压的基因治疗真正实现，专利技术人将人类血管紧张素II受体I反义基因(AT1-AS)与重组腺相关病毒载体重组构建，利用有效的包装系统进行包装成为含AT1-AS基因的重组腺相关病毒，并获得可以满足治疗要求的滴度，以满足临床治疗的需要。实现本专利技术的具体技术方法是该表达人类血管紧张素II受体I反义基因的重组腺相关病毒(rAAV)，其该载体系统该载体系统包括包装质粒pXX2，辅助质粒pXX6，真核表达载体pXXUF1，并在真核表达载体pXXUF1内插入了人类血管紧张素II受体I反义基因编码序列。该重组腺相关病毒由天然状态的腺相关病毒经分子生物学方法人工剪切、修饰和加工而成。其中pXX2为包装质粒，含有编码腺相关病毒Rep蛋白和Cap蛋白的编码序列，并在上游和下游各插入一个p5启动子。pXX6为辅助质粒，删除了腺病毒的致病基因序列，保留了腺病毒E1A、E2A和VA1RNA基因，它们表达的蛋白质可发挥辅助作用以刺激rAAV基因的转录和翻译。pXXUF1真核表达载体，所用的是CMV启动子，其含有一多克隆位点(pXXUF1为NotI位点)，可以连接不同的目的基因。该重组腺相关病毒是表达人类血管紧张素II受体I反义基因的重组腺相关病毒rAAV-AT1-AS。专利技术人提出的人类血管紧张素II受体I反义基因由PCR法从人体白细胞基因组中克隆而得。它包括有效量的表达人类血管紧张素II受体I反义基因的重组腺相关病毒和药学上所接受的载体或赋形剂。再则，该重组腺相关病毒由天然状态的腺相关病毒和腺病毒经分子生物学方法人工剪切、修饰和加工而成。该重组腺相关病毒是表达人类血管紧张素II受体I反义基因的重组腺相关病毒rAAV-AT1-AS。制备表达人类血管紧张素II受体I反义基因的重组腺相关病毒(a)、提供腺相关病毒包装所必需的Rep蛋白和Cap蛋白的编码序列——pXX2质粒，和刺激腺相关病毒复制和转录所必需的腺病毒E1A、E2A和VAIRNA基因——pXX6质粒。(b)、提供含腺相关病毒基因组的真核表达载体pXXUF1，在该真核载体中腺相关病毒缺失cap蛋白和rep蛋白编码区，并插入人类血管紧张素II受体I反义基因，形成重组质粒pXXUF1-AT1-AS。(c)、将步骤α中的pXX2、pXX6和pXXUF1-AT1步骤(b)共转染293细胞，适时回收，并纯化、检测其病毒滴度。将步骤(c)中回收纯化的病毒经尾静脉注射入自发性高血压大鼠体内，检测其生物学活性。在步骤(c)共转染的方法是钙磷DNA共沉淀转染法。真核载体pXXUF1所含启动子为CMV启动子。纯化是用SSCP法，而检测滴度是用斑点杂交法。在步骤4中预计检测的结果将说明该种表达人类血管紧张素II受体I反义基因的重组腺相关病毒(rAAV-AT1-AS)在生物体内可长期高效表达，发挥其降低血压、改善肾脏功能、防止心脏及血管重构等生理和病理生理作用，以期用于临床，从而实现高血压、心力衰竭，冠心病，脑血管疾病，肾脏疾病及其他相关疾病的基因治疗。附图说明图1 本专利技术腺相关病毒的序列及具体分区图2 本专利技术腺相关病毒的基因级构造3 ITR的序列及二级结构4 腺相关病毒的转录和翻译中有增殖性和潜优性的两种表达方式图5 在AAV的增殖性表达中可转录生成6种mRNA的表达方式图6 PXXZZ、PXX6质粒构成图7 PXXUF1质粒构成图8 人类血管紧张素II受体I基因片段的序列图9 PXXUF1-AT1-AS的质粒构成下面进一步描述本专利技术重组腺相关病毒的各部组成特点及其制备方法一、天然腺相关病毒(AAV)及重组腺相关病毒(rAAV)载体的特征腺相关病毒是一种动物单链DNA病毒，它属于细小病毒科，细小病毒亚科，依赖病毒属，自然缺陷、无包被和无致病原性。1、AAV基因组是一个线性、单链(ssDNA)分子，含4680个核苷酸(序列如图1)，其特征在于1)其基因组由4个开放阅读宽读框(ORF)组成，分称rep区、lip区、inf区和cap区(见图1、图2)。位于基因组DNA左端的一个大ORF由于移码突变或缺失会阻止DNA复制，因而被称为rep区。右端的一个大ORF(cap)编码合成3种外壳蛋白。另有两个小ORF位于基因组DNA的中央区，即inf区和lip区。2)在分子单链每个末端含有一个145个碱基末端重复序列(ITR)(见图1)。ITR序列折叠成发卡结构作为DNA复制起始和包装重组AAV基因组为感染性的病毒颗粒所需的唯一已知顺式作用元件(见图3)。 3)腺相关病毒的复制和转录调节相当复杂，按有无辅助病毒的共转染分，有增殖性和潜伏性两种表达方式(如图4)。在AAV的增殖性表达中，可转录生成6种mRNA，分别由启动子P5、P19、P40启动合成(如图5)。在腺病毒(Ad)的共转染的情况下，Ad的E1A基因负责AAV基因表达的反式激活；Ad E2A基因编码单链DNA结合蛋白，可刺激AAV启动子所启动的转录，还可促进AAV转录本从胞核向胞质转运；另外Ad VA1 RNA可能也有利于AAV蛋白合成的起始。而AAV也能够正调节和负调节自身基因和辅助病毒基因表达。AAV的rep基因能够正调节和负调节P5、P19、P40启动子所启动的转录，在有Ad的情况下，rep基因产物行使正调节功能，这是AAV基因大量合成所必须的；而在无辅助病毒共转染的情况下，rep基因产物则起负调节作用本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种表达人类血管紧张素Ⅱ受体Ⅰ反义基因的重组腺相关病毒（ｒＡＡＶ），它适用于高血压、肾脏疾病及其他相关疾病的基因治疗，其特征在于：该载体系统包括包装质粒ｐＸＸ↓［２］，辅助质粒ｐＸＸ↓［６］，真核表达载体ｐＸＸＵＦ↓［１］，并在真核表达载体ｐＸＸＵＦ↓［１］内插入了人类血管紧张素Ⅱ受体Ⅰ反义基因编码序列。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：汪道文，肖啸，孔强，王涛，
申请(专利权)人：华中科技大学同济医学院附属同济医院，
类型：发明
国别省市：83[中国|武汉]