一种植物DNA病毒侵染性载体构建方法技术

一种植物ＤＮＡ病毒侵染性载体的构建方法，其特征在于，其步骤为： １）从收集的双生病毒发病株中提取基因组总ＤＮＡ； ２）以植物总ＤＮＡ为模板，设计简并引物对双生病毒的两个组分ＤＮＡ－Ａ和ＤＮＡβ进行ＰＣＲ扩增，扩增产物克隆至Ｔ－Ｖｅｃｔｏｒ； ３）对克隆产物进行阳性克隆的筛选并进行序列测定； ４）序列测定结果通过ＤＮＡ分析软件进行组合、拼接，获得ＤＮＡ－Ａ组分和ＤＮＡβ组分的全长基因组序列； ５）在序列测定的基础上，利用Ｏｖｅｒｌａｐ－ＰＣＲ和限制性酶切的方法把ＤＮＡ－Ａ组分的１．７个重复的基因组构建到改良型植物表达载体上，获得带有ＤＮＡ－Ａ组分的重组植物表达载体，并将其导入大肠杆菌细胞； ６）使用５）中相同的方法把两个正向重复的ＤＮＡβ组分构建到改良型植物表达载体上，获得带有ＤＮＡβ组分的重组植物表达载体，并将其导入大肠杆菌细胞； ７）通过三亲交配的方法把大肠杆菌细胞中的带有ＤＮＡ－Ａ组分的重组植物表达载体和带有ＤＮＡβ组分的重组植物表达载体导入具有较强感染能力的农杆菌菌株ＥＨＡ１０５； ８）重组载体导入农杆菌菌株以后，带有ＤＮＡ－Ａ和ＤＮＡβ的农杆菌接种５ｍｌ ＹＥＰ液体培养基培养； ９）侵染性测定时，试验植株选用４－６叶充分展开的苗龄期的植株为宜，接种组合为单ＤＮＡ－Ａ接种，单ＤＮＡβ接种和ＤＮＡ－Ａ＋ＤＮＡβ接种； １０）接种时，取１ｍｌ一次性针筒吸取农杆菌菌液对植株进行伤口感染，接种的具体方法和部位：在距离根部１－２ｃｍ处取三点进行韧皮部注射，或在叶片的叶柄处取三点进行注射，或在上部嫩叶背部用带有菌液的针头对叶脉产生伤口使菌液进入植株体内； １１）接种植株置于２５℃隔离温室培养，１０－３０ｄｐｉ后观察接种植株的症状； １２）对出症状和没有出症状的植株进行ＥＬＩＳＡ、ＰＣＲ和Ｓｏｕｔｈｅｒｎ Ｂｌｏｔ检测以鉴定其侵染性。（*该技术在2022年保护过期，可自由使用*）

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】
本专利技术涉及基因工程领域，尤其涉及一种植物DNA病毒侵染性载体构建方法。
技术介绍
植物病毒侵染性载体是研究病毒功能基因组的至关重要的平台，在分子生物学水平上研究病毒基因组结构与功能以及寄主与病毒之间的互作，必须要获得病毒的侵染性克隆，在此基础上才能获得野生型分子或者突变型分子的均一群体，进而利用DNA重组技术进行突变、缺失、插入、置换以及互补实验对病毒基因组进行功能区域的定位，从而能在寄主植物表型水平上反映和评价基因功能的表达。该技术是深入研究病毒的基因功能以及病毒与寄主植物互作的有效手段，该技术首先在噬菌体病毒Qβ(Taniguchi 1978)，脊髓灰质炎病毒(Racaniello 1981)中获得成功，植物RNA病毒是1983年在雀麦花叶病毒(bromemosaic virus，BTV)(Ahlquist 1983)上首次获得侵染性cDNA克隆，而植物DNA病毒的侵染性克隆是1982年在番茄金色花叶病毒(TGMV)上通过磨擦接种的方法首次构建成功的。虽然该技术产生较迟，但是发展却是极为迅速，现已作为前沿技术被广泛应用于各个领域，除了用于病毒基因组结构、功能和表达调控机制研究以外，它还被应用于其它两个非常重要、有潜力的领域。一个是利用病毒载体进行外源蛋白表达。通过转基因的方法表达外源蛋白，工作量大，周期性长，获得的外源蛋白浓度低，而植物病毒一般都具有很强的繁殖能力，并且构建简易，周期性短，是一种理想的工具载体。另外一个是利用病毒诱导的基因沉默进行功能基因组研究，近几年的最新研究发现，在生物界RNA存在一种Guiding的机制，它能够形成dsRNA，并能够特异性的降解其同源序列，利用这一机制，在病毒载体上插入植物的一段同源基因就可沉默植物中的基因，从而通过正向遗传学的方法研究植物的功能基因组。植物病毒是一种非常理想的模式，其基因组小，结构简单，易于分子生物学操作，而植物DNA病毒基因组稳定的特性相对于RNA病毒更优于分子生物学的操作以及外源蛋白表达载体的应用。本专利技术以粉虱传双生病毒中国番茄黄化曲叶病毒为材料来建立侵染性载体构建的方法。粉虱传双生病毒(whitefly-transmitted geminivirus，WTG)是世界范围内广泛发生的一类植物单链DNA病毒，病毒基因组大部分是双组分(DNA-A和DNA-B)，DNA-A和DNA-B基因组大小2.5-3.0kb，DNA-A和DNA-B序列之间有一非常保守的共同区，如番茄金花叶病毒(tomato golden mosaic virus，TGMV)，非洲木薯花叶病毒(Africa cassava mosaic virus，ACMV)，菜豆金花叶病毒(Beangolden mosaic virus，BGMV)，还有一些病毒是单组分，并且单组分足以引发病毒的成功侵染和致病症状，如番茄黄花叶病毒(tomato yellow mosaicvirus，ToYMV)，番茄花叶病毒(tomato mosaic virus，ToMV)。近年来，在单组分双生病毒上发现一种新型的卫星DNAβ分子，该分子大小约为DNA-A的一半，DNA-A必需依赖与这个新型的卫星分子DNAβ才能在寄主上引发典型的症状。本专利技术的侵染性构建过程中涉及这一新型的卫星DNA分子。纵观双生病毒侵染性载体构建的历史发展，主要有三种方法1.磨擦接种法；2.基因枪法；3.农杆菌注射法。磨擦接种法只适用于能够机械传染的病毒，而大部分双生病毒都不能经过磨擦接种而侵染寄主植物，因此这一方法存在很大的局限性。使用基因枪法时，构建克隆简易，但高度依赖于实验设备，并且每次基因枪轰击所耗金粉的费用昂贵，这在大规模实验时将收到成本太高的限制。使用农杆菌注射法，首先在dsDNA病毒中的花椰菜花叶病毒中成功应用(Grimsley 1986)，并逐渐被应用于双生病毒，它是一种简易，有效的方法，但是已往所用的植物表达载体复制量低，不易进行分子生物学操作，本专利技术基于中国黄化曲叶病毒基因组DNA-A和新型卫星分子DNAβ，对这一方法进行了改造。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种植物DNA病毒侵染性载体构建方法。植物DNA病毒侵染性载体构建方法，其步骤为1)从中国云南地区收集双生病毒的样本，提取基因组总DNA；2)以植物基因组总DNA为模板，设计简并引物对双生病毒的两个组分(DNA-A和DNAβ)进行PCR扩增，扩增产物克隆至T-Vector；3)对克隆产物进行阳性克隆的筛选并进行序列测定；4)序列测定结果通过DNA分析软件进行组合、拼接，获得DNA-A组分和DNAβ组分的全长基因组序列；5)在序列测定的基础上，利用Overlap-PCR和限制性酶切的方法把DNA-A组分的1.7个重复的基因组构建到改良型植物表达载体上，获得带有DNA-A组分的重组植物表达载体，并将其导入大肠杆菌细胞； 6)使用5)中相同的方法把两个正向重复的DNAβ组分构建到改良型植物表达载体上，获得带有DNAβ组分的重组植物表达载体，并将其导入大肠杆菌细胞；7)通过三亲交配的方法把大肠杆菌细胞中的带有DNA-A组分的重组植物表达载体和带有DNAβ组分的重组植物表达载体导入具有较强感染能力的农杆菌菌株EHA105；8)重组载体导入农杆菌菌株以后，带有DNA-A和DNAβ的农杆菌接种5ml YEP液体培养基28℃培养以进行侵染性测定；9)侵染性测定时，试验植株选用4-6叶充分展开的苗龄期的植株为宜，接种组合为单DNA-A接种，单DNAβ接种和DNA-A+DNAβ接种；10)接种时，取1ml一次性针筒吸取农杆菌菌液对植株进行伤口感染，接种的具体方法和部位在距离根部1-2cm处取三点进行韧皮部注射，或在叶片的叶柄处取三点进行注射，或在上部嫩叶背部用带有菌液的针头对叶脉产生伤口使菌液进入植株体内；11)接种植株置于25℃隔离温室培养，10-30dpi后观察接种植株的症状；12)对出症状和没有出症状的植株进行ELISA、PCR和Southern Blot检测以鉴定其侵染性。本专利技术的优点1)构建双生病毒侵染性载体需要构建1.3-2.0个重复以上的基因组克隆。抽提总DNA进行氯化铯离心纯化提取大量scDNA并进而酶切得到全长基因组是一种构建两个重复的可行的策略，但这种方法需要大量的样品，对于不能机械传播的双生病毒来说，进行病毒毒源的扩繁是一重大障碍，本专利技术使用Overlap-PCR和酶切的方法对不同的克隆进行拼接，拼接组合，可以得到任何1.3-2.0个重复以上的病毒基因组克隆；2)传统的农杆菌介导法使用pBinl9，这个载体复制量小，加上本身质粒大，对其进行重组克隆时不易操作，本专利技术使用对其复制起始位点经过改良的改良型植物表达载体pBinPLUS，其复制量大大加强，并且感染植物的效率也大大加强。在这个改良型载体上也可以直接进行简单方便的操作；3)常规农杆菌介导法的宿主细胞对植物的感染能力较低，本专利技术使用对植物细胞转移能力大、侵染能力强的农杆菌菌株；4)磨擦接种法仅限于机械传播的病毒；基因枪法受设备和资金的限制，以及病毒轰入植株后发病率不高；本专利技术采用改良型农杆菌介导的方法，构建方法简易，不受严格条件的限制，接种方法简单、侵染性强、发病率高、应用性广；5)本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】

【专利技术属性】
技术研发人员：周雪平，陶小荣，崔晓峰，谢艳，李正和，
申请(专利权)人：浙江大学，
类型：发明
国别省市：