本发明专利技术涉及转基因动物、与基因功能鉴定相关的组合物和方法。（*该技术在2020年保护过期，可自由使用*）
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及转基因动物、与基因功能鉴定相关的组合物和方法。
技术介绍
在人类基因组中已经鉴定出许多多态三核苷酸重复。这些突变由可遗传的不稳定DNA产生，被称为“动态突变”，因为在世代之间遗传的重复单位的数目是变化的(Koshy等，Brain Pathol，7927-42(1997))。虽然这些重复是高度多态性的，但其数量在正常个体中通常不超过40个重复(Online Mendelian Inheritance in Man，OMIM(TM).Johns Hopkins University，Baltimore，MD.MIM Number603279jlewis7/14/1999；World Wide Web URLhttp//www.ncbi.nlm.nih.gov/omim；Koshy等(1997))。相比之下，已经发现异常扩增的三核苷酸重复引起疾病(OMIM603279)。致病的扩增通常含有超过40个三核苷酸重复，已经报道了200个或更多重复的序列段(OMIM 603279；Slegtenhorst-Eegdeman等，Endocrinology，139156-62(1998))。已经鉴定出四种类型的三核苷酸重复扩增(1)两种脆性X染色体综合征(FRAXA和FRAXE)中的长胞嘧啶-鸟嘌呤-鸟嘌呤(CGG)重复，(2)肌强直性营养不良中的长胞嘧啶-胸腺嘧啶-鸟嘌呤(CTG)重复扩增，(3)Friedreich共济失调中的长鸟嘌呤-腺嘌呤-腺嘌呤重复扩增，和(4)涉及神经变性性疾病的短胞嘧啶-腺嘌呤-鸟嘌呤重复扩增(CAG)。(Koshy等(1997))。分类为1型和2型疾病的至少12种疾病由三核苷酸扩增突变所致，大多数具有神经精神特征(Margolis等，Hum Genet.，100114-122(1997))。1型疾病由可读框中的(CAG)n扩增引起，产生扩增的谷氨酰胺重复。1型疾病包括1型脊髓小脑性共济失调(SCAl，Orr等，NatGenet，4221-6(1993))、SCA2(Imbert等，Nat Genet，14285-91(1996)；Pulst等，Nat Genet，14269-76(1996)；Sanpei等，Nat Genet，14277-84(1996))、Machado-Joseph病(MJD或SCA3，Kawaguchi等，Nat Genet，8221-8(1994))、SCA6(Zhuchenko等，Nat Genet，1562-9(1997))、dentatutorubral pallidoluysioan atrophy(DRPLA，Koide等，Nat Genet，69-13(1994))、亨廷顿舞蹈病(HD，Huntington’s Disease CollaborativeResearch Group，Cell，72971-83(1993))和脊髓延髓性肌萎缩(SBMA，LaSpada，Nature，35277-9(1991))。2型疾病可以由5’非翻译区中的扩增(Jacobsen综合征，Jones等，Nature，376145-9(1995)；脆性X染色体综合征，Fu等，Science，1992 2551256-8(1992))、3’非翻译区中的扩增(肌强直性营养不良，Brook等，Cell，68799-808(1992)；Philips等，Science，280737-41(1998))和内含子区中的扩增(Fredreich共济失调，Campuzano等，Science，2711423-7(1996))引起。然而，对于扩增事件的机理和发生时间知之甚少(Bates等，Hum Mol Genet.，61633-7(1997))。由三核苷酸重复扩增引起的疾病表现出称为早现遗传的现象，这种现象不能用传统的孟德尔遗传学来解释(Koshy等(1997))。早现遗传的定义是在连续世代中疾病的严重程度增加并且症状出现的年龄更早。早现遗传通常受遗传亲代性别的影响，对于大多数CAG重复性疾病而言，当为母性遗传时这种疾病更为严重。该病的严重程度和发病年龄与重复序列的大小有关(Koshy等(1997))。较大的扩增导致更早发病和临床表现更为严重。早现遗传的现象已经使人们怀疑，所述扩增重复的不稳定性是特定疾病的基础(OMIM 603279)。带有扩增的三核苷酸重复序列段的蛋白质是不相关的，并且广泛表达，而且表达模式广泛重叠(Bates等(1997))。大多数蛋白是新的，但雄激素受体和电压门控αlA钙通道例外，它们在脊髓延髓性肌萎缩和6型脊髓小脑性共济失调中有突变。有趣的是，CAG重复蛋白在周围神经组织和中枢神经组织中均广泛表达，但在每种神经病中，仅一个选定的神经细胞群体由于所述扩增的重复而成为变性的靶(Koshy等(1997))。尚不了解扩增导致神经元机能障碍和细胞死亡的机理(Bates等(1997))。目前的看法是，重复序列段的存在使所涉及的基因、信使或蛋白质获得功能。例如，已假定肌强直性营养不良基因(MD)转录物的扩增CUG重复区与CUG结合蛋白的不当相互作用逐渐演变出(titrate-out)通常构成(comprise)不均一核内核糖核蛋白颗粒的蛋白质(Bhagwati等，Biochim Biophys Acta，1317155-7(1996)；Philips等(1998))。也已经提出，产生新型蛋白质-蛋白质相互作用或异常的蛋白质折叠以及侧翼基因表达和染色质结构的改变是三核苷酸扩增可能致病的机理(Thomton等，Nat.Genet.，16407-9(1997))。三核苷酸重复性疾病的小鼠模型对于揭示这些疾病的分子基础和开发治疗干涉而言有很大潜力和前景。转基因小鼠再现了人类疾病的许多特征，因而是研究体内疾病发展的优良模型系统。应用这种小鼠，将有可能在所述小鼠中对致病机理和三核苷酸重复的不稳定性进行建模(Bates等(1997))。专利技术概要本专利技术总的来说涉及转基因动物以及与基因功能鉴定相关的组合物和方法，更具体地讲，本专利技术涉及编码三核苷酸重复蛋白(TRP)的基因，例如基因T243。本专利技术提供在编码TRP的靶DNA序列中包含破坏的细胞，优选干细胞，更优选胚胎干(ES)细胞。最好是，所述靶DNA序列是T243。在一个优选实施方案中，所述干细胞是鼠类ES细胞。按照一个实施方案，通过获得与所述靶DNA序列同源的序列，并将所述序列插入打靶构建体中，产生所述破坏。然后将打靶构建体导入所述干细胞中，构建在所述靶DNA序列中产生破坏的同源重组体。在一个更优选的实施方案中，采用不依赖连接作用的克隆，将所述同源序列的两种不同片段插入具有第二多核苷酸序列(最好是编码正选择标记的基因)的载体中，使得所述第二多核苷酸序列定位于所述构建体中的所述两种不同的同源序列片段之间，构建所述打靶构建体。在该实施方案的一个方面，所述同源序列可以通过以下方法获得产生与所述靶互补的两种引物；使所述引物退火到小鼠基因组DNA文库中含有所述靶区域的互补序列上；并且扩增与所述靶区域同源的序列。然后分离出具有由所述引物形成的终点的扩增反应产物。最好是通过PCR进行扩增，更优选通过长距离PCR(long-ra本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种细胞，所述细胞在编码ＴＲＰ的靶ＤＮＡ序列中包含破坏。
【技术特征摘要】
...
【专利技术属性】
技术研发人员：R克莱恩，W马休斯，M莫雷，KD阿伦，
申请(专利权)人：德尔塔根公司，
类型：发明
国别省市：US[美国]
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