在制备多肽的方法中有效的真菌转录激活因子技术

本发明专利技术涉及分离的核酸序列，其编码具有转录激活活性的多肽，同时本发明专利技术涉及所述的多肽。本发明专利技术还涉及包括所述核酸序列的核酸构建体、载体以及宿主细胞。本发明专利技术进一步涉及有效用于制备所述多肽的宿主细胞，在所述的宿主细胞中转录激活因子的产生或功能被改变，本发明专利技术还涉及用于制备所述多肽的方法。（*该技术在2021年保护过期，可自由使用*）

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】
本专利技术涉及分离的核酸序列，其编码具有转录激活活性的多肽，本专利技术还涉及所述的多肽。本专利技术还涉及包括所述核酸序列的核酸构建体、载体以及宿主细胞。本专利技术进一步涉及有效用于制备所述多肽的宿主细胞，在所述的宿主细胞中转录激活因子的产生或功能被改变，本专利技术还涉及用于制备所述多肽的方法。
技术介绍
近年来，重组宿主细胞在异源蛋白表达中的应用大大简化了商品化蛋白的大量制备，否则只有通过从其天然来源中纯化才能获得所述的蛋白。目前，可以选择不同的表达系统，包括细菌和真核宿主，从所述的系统中选择用于制备任何特定蛋白。对适当表达系统的选择通常不仅有赖于宿主细胞在活跃状态产生足够产量蛋白的能力，而且在很大程度上也可能由所述蛋白预期的最终用途决定。经常遇到的一个问题是由特定宿主细胞产生的或存在于培养基中的高水平的蛋白水解酶。一个建议是提供失去了产生特异性蛋白水解化合物能力的宿主生物体。例如，WO 90/00192(Genencor，Inc.)描述了不能分泌有酶活性的天冬氨酸蛋白酶的丝状真菌宿主。EP 574 347(Ciba Geigy AG)描述了枯草杆菌蛋白酶型的丝氨酸蛋白酶缺陷的曲霉宿主。WO 98/12300(NovoNordisk A/S)描述了金属蛋白酶以及碱性蛋白酶缺陷的宿主。WO97/12045(Genencor，Inc.)描述了由于参与蛋白酶基因调节的启动子序列的破坏而导致造成蛋白酶缺陷的酵母和细菌宿主系统。Mattem，I.E.等，(1992.分子和普通遗传学(Mol Gen Genet)234332-336)描述了黑曲霉的一个突变株，其被表明仅仅具有亲代菌株1％到2％的细胞外蛋白酶活性，这显然是由于至少两种蛋白酶曲霉胃蛋白酶A(aspergillopepsinA)和曲霉胃蛋白酶B(aspergillopepsin B)的缺陷。提示蛋白酶缺陷表型可能由影响编码两种蛋白酶基因表达的调控性突变造成。真核转录在一个特定启动子或一组启动子处的起始需要一种真核转录激活因子，其为一种多肽，但其本身不是RNA聚合酶的一部分。许多转录激活因子结合至启动子上的特定位点形成起始该多肽编码序列的转录所需的一种功能性启动子。然而，只有在其他多肽存在下，转录激活因子也可以被并入一种转录起始复合物。对真菌中具有转录激活活性的多肽已经进行了描述，而且已公开了此类多肽的名单(Dhawale，S.S.，和Lane，A.C.1993.核酸研究(Nucleic Acid Research)215537-5546)。本专利技术建议的解决方法本专利技术的一个目的是提供改进的方法用于在宿主细胞中增加多肽的产生，在所述的宿主细胞中参与调节蛋白酶产生的转录激活因子的活性被改进。专利技术简述本专利技术的一个方面涉及一种分离的编码转录激活因子的核酸序列，其选自(a)与SEQ ID NO1或SEQ ID NO48的核酸序列有至少70％同一性的核酸序列；(b)编码一种多肽的核酸序列，所述多肽的氨基酸序列与SEQ ID NO2或SEQ ID NO49的氨基酸序列有至少50％的同一性。(c)在低严谨度条件下与(i)SEQ ID NO1或SEQ ID NO48的核酸序列，或者(ii)其互补链杂交的核酸序列，其中将低严谨度条件定义为于42℃在5×SSPE、0.3％SDS、200μg/ml剪切并变性的鲑鱼精DNA和25％甲酰胺中预杂交和杂交，并将洗涤条件定义为于50℃在2×SSC、0.2％SDS中洗涤30分钟；(d)(a)、(b)或(c)的等位基因变体；(e)(a)、(b)、(c)或(d)的亚序列，其中该亚序列编码一种具有转录激活活性的多肽片段；以及(f)(a)、(b)、(c)或(d)的亚序列，其中该亚序列编码一种具有SEQ ID NO3的氨基酸序列的多肽。表示为SEQ ID NO1的核酸序列是黑曲霉(Aspergillus niger)prtT基因，其编码在下面所述和实施例中的表示为SEQ ID NO2的转录因子。表示为SEQ ID NO48的核酸序列是米曲霉(Aspergillus oryzae)IFO4177prtT基因，其编码SEQ ID NO49所示的转录因子。米曲霉prtT基因具有一个以795位点开始的编码区，并以2931位点结束。所述prtT基因分别在位点1028-1135，1538-1591，2018-2066，和2297-2347具有4个内含子。下文和实施例中对此进行详述。在另一方面，本专利技术还涉及包括所述核酸序列的核酸构建体、载体和宿主细胞，以及由所述核酸序列编码的多肽。本专利技术进一步涉及可用于制备多肽的宿主细胞，在所述的宿主细胞中转录激活因子的产生或功能被改变，本专利技术还涉及用于制备所述多肽的方法。附图简述附图说明图1显示质粒pPAP的限制性图谱，其构建过程在实施例1中描述。图2显示质粒pAopyrGcosArp1的限制性图谱，其构建过程在实施例1中描述。图3显示质粒pEES1的限制性图谱，其构建过程在实施例1中描述。图4显示质粒pDprt的限制性图谱，其构建过程在实施例3中描述。图5显示质粒pGPprt的限制性图谱，其构建过程在实施例4中描述。图6显示在包含米曲霉prtT Zn2+-指状结构的PCR片段的两个质粒插入的序列。ICA217是来自于其中一个质粒的序列，ICA218是另一个的。图7显示了基于pSP65(PromegTM)的质粒pDV8，其包含一个在1.2kbBglII/BamHI片段上的HSV-tk基因，所述基因插入到构巢曲霉(A.nidulans)gpd启动子的1.0kb XhoI/BglII片段和含有构巢曲霉trpC转录终止子0.8kb BamHI/HindIII片段之间。图8显示了实施例8所述的pJaL554的构建。专利技术详述编码转录激活因子的核酸序列本专利技术一方面涉及一种分离的编码转录激活因子的核酸序列，其选自(a)与SEQ ID NO1或SEQ ID NO48的核酸序列有至少70％同一性的核酸序列；(b)编码一种多肽的核酸序列，所述多肽的氨基酸序列具有与SEQ IDNO2或SEQ ID NO49的氨基酸序列有至少50％同一性。(c)在低严谨度条件下与(i)SEQ ID NO1或SEQ ID NO48的核酸序列，或者(ii)其互补链杂交的核酸序列，其中将低严谨度条件定义为于42℃在5×SSPE、0.3％SDS、200μg/ml剪切并变性的鲑鱼精DNA和25％甲酰胺中预杂交和杂交，并将洗涤条件定义为于50℃在2×SSC、0.2％SDS中洗涤30分钟；(d)(a)、(b)或(c)的等位基因变体；(e)(a)、(b)、(c)或(d)的亚序列，其中该亚序列编码一种具有转录激活活性的多肽片段；以及(f)(a)、(b)、(c)或(d)的亚序列，其中该亚序列编码一种具有SEQ ID NO3的氨基酸序列的多肽。本文中所用的术语“转录激活因子”指能激活一个特定启动子或一组启动子的多肽，所述的启动子是其连接的多肽编码序列转录起始所必需的。本文中所用的术语“分离的核酸序列”指一种基本上没有其他核酸序列的核酸序列，例如通过琼脂糖电泳测定纯度为至少大约20％，优选至少大约40％，更优选至少大约60％，甚至更优选至少大约80％，最优选至少大约90％。例如，分离的本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种分离的核酸序列，其编码一种具有转录激活活性的多肽，其选自： （ａ）与ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１或ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４８的核酸序列有至少７０％的同一性的核酸序列； （ｂ）编码一种多肽的核酸序列，所述多肽具有与ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２或ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４９的氨基酸序列至少５０％的同一性的氨基酸序列。 （ｃ）在低严谨度条件下与（ｉ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１或ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４８的核酸序列，或者（ｉｉ）其互补链杂交的核酸序列，其中将低严谨度条件定义为于４２℃在５×ＳＳＰＥ、０．３％ＳＤＳ、２００μｇ／ｍｌ剪切并变性的鲑鱼精ＤＮＡ和２５％甲酰胺中预杂交和杂交，并将洗涤条件定义为于５０℃在２×ＳＳＣ、０．２％ＳＤＳ中洗涤３０分钟； （ｄ）（ａ）、（ｂ）或（ｃ）的等位基因变体； （ｅ）（ａ）、（ｂ）、（ｃ）或（ｄ）的亚序列，其中该亚序列编码一种具有转录激活活性的多肽片段；以及 （ｆ）（ａ）、（ｂ）、（ｃ）或（ｄ）的亚序列，其中该亚序列编码一种具有ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３的氨基酸序列的多肽。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】...

【专利技术属性】
技术研发人员：卡斯滕M约尔特，CMJJ范登杭德尔，PJ庞特，FHJ舒伦，托夫克里斯坦森，
申请(专利权)人：诺维信公司，
类型：发明
国别省市：DK[丹麦]