低温贮藏所选精细胞的方法技术

本发明专利技术提供了一种低温贮藏精子的方法，该精子由于具有某种特殊特征而被选。在一个优选的实施方案中，该方法被用来冷冻按性别选择的精子。虽然本发明专利技术的低温贮藏方法可用于冷冻各种选择方法选择出的精子，但是使用流动细胞计量术所进行的选择为优选。本发明专利技术也提供了一种冷冻的精子样品，该精子由于具有某种特殊特征，例如性别类型，而被选择。在优选的实施方案中，该冷冻的精子样品包括哺乳动物的精子，例如人的、牛的、马的、猪的、绵羊的、麋鹿的或野牛的精子。该冷冻的选定精子样品可在各种应用中使用。具体说来，该样品可被解冻然后用于受精。因此，本发明专利技术也包括使用该冷冻的选定精子样品进行人工受精或体外受精的方法。（*该技术在2020年保护过期，可自由使用*）

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】
本专利技术涉及冷冻由于某一特殊特征而被选出的精子的方法，也涉及冷冻的选定精子样品和使用该样品的方法。本专利技术对保存按性别选择的精子尤其有用。
技术介绍
半个多世纪以前，人工授精作为对各种哺乳动物物种的商业饲养工具传入美国。虽然人工授精最初被限制在相对靠近精子收集点的区域，但是低温贮藏和精子存储上的进步已经推动了计划用于人工授精或体外受精的精子的广泛分布及其商业化。在哺乳动物精子收集、选择、低温贮藏、存储和操作技术上的进一步进步已经增强了饲养者生产具有所需特征的动物的能力。例如，基于身体特征细微差异的哺乳动物精子选择上的进步使得按性别类型将精子分开，也就是说选择含X或Y的细胞，成为可能。这一技术使得饲养者可以在一个样品中对X或Y型精子的相对百分比进行控制并因此决定后代的性别。基于性别类型或任何其它令人满意的特征来选择精子的能力，为促进遗传学的进步、提高生产效率以及在牲畜管理上获得更大的弹性，提供了一个重要的工具。然而，这一工具的完全开发依赖于冷冻和存储所选定精子的能力。选择细胞有各种方法；然而，由于精子无法进行DNA修复且由于精子的形态学，精子的选择和接下来的处理面临着唯一的挑战。每个精子都有一个覆盖其头的顶体和一个尾，其对生育力是十分重要的并且其相对来说易受物理损伤。另外，精子的生育力随收集与使用之间时间的增加而下降。由于大部分可用的选择方法既有物理压力又费时，所以选定的精子与未被选中的细胞相比通常多少都有点损伤。如果选择技术涉及明显的稀释作用的话，生育力可能会被进一步降低。这暗示，该“稀释效应”可能是由于精清中保护性成分的损失造成的。流动细胞计量术是一种十分有效的选择方法，其已被用于按性别类型对精子进行分类。然而，所挑选的精子易受通常在标准人工受精中或在体外受精操作中遇到的那些压力以外的压力的影响。尤其是流动细胞计量术非常耗时，并且，由于流动细胞计的物理限制，精子必须要被稀释到并不最适合存储的水平来进行分类。(通常为105-106/ml)。而且，必须对所挑选的、打算用于人工受精的精子进行浓缩，从而可以使用常规的包装和递送装置。因此，增加一个浓缩步骤就已经或多或少地将受损伤的精子置于额外的物理压力之下了。精子的冷冻也总是会降低其生育力、运动性和/或生存能力，而且，虽然冷冻未经选择的精子的技术已广为所知，但是低温贮藏选定的精子的技术还未见有述。专利技术摘要本专利技术提供了一种低温贮藏精子的方法，该精子由于具有某种特殊特征而被选。因为该方法提供了从选定的精子样品中将精子分离出来，然后向所分离的精子中加入终增容剂以产生具有所要求精子浓度的悬浮液，所以该方法尤其适用于低温贮藏通过导致精子稀释的方法选择的精子。在一优选实施方案中，该方法被用于冷冻性别选择的精子。虽然本专利技术的低温贮藏方法可被用于冷冻经任意多个选择方法选择出的精子，但优选使用流动细胞计量术进行选择。本专利技术也提供了一种冷冻的精子样品，该样品因其某种特殊特征而被选，例如性别类型。在优选实施方案中，冷冻的精子样品包括哺乳动物的精子，例如人、牛、马、猪、绵羊、麇鹿或野牛的精子。含有本专利技术冷冻精子样品的容器也在本专利技术的范围之内。该冷冻的选定精子样品可在各种应用中使用。具体来说，可将该样品解冻并用于受精。因此，本专利技术也包括使用该冷冻的选定精子样品进行人工受精或体外受精的方法。本专利技术详述本专利技术使低温贮藏那些由于某种特殊特征而被选出的精子成为可能，并使得选定精子样品的存储和/或向远离收集点的地方的运输更加便利。解冻后可产生可在例如人工受精(“AI”)和体外受精(“IVF”)的方法中使用的活精子。这一结果令人感到惊讶，因为精子一直被认为是脆弱的。以前的研究人员已经证明，与各种选择方法或与低温贮藏关联的压力会使精子的生育力和/或生存能力明显下降。本专利技术首次论证了用选择并随后被冷冻的精子可以怀孕。本专利技术代表了牲畜管理上的一大进步，为了在这些方法中使用而进行的精子选择可被用来增加具有所需特性后代的生产。例如，为获得带有X或Y染色体的精子而进行的选择使对后代性别的控制成为可能，其对动物生产者，例如乳牛或肉牛，是十分有利的。性别选择也可用于饲养有价值的(例如表演或比赛的马)或濒危的动物。本专利技术所提供的、冷冻选定精子的能力将会使那些选择方法得到广泛使用，以例如提高牲畜的生产效率和质量。定义术语“顶体”或“顶体帽(acrosomal cap)”是指覆盖精子头部前半部分并含有穿入卵子所需酶的帽。术语“性别类型”是指精子中性染色体的类型(即X或Y染色体)。术语“获能”是指精子经受的、以发展其使卵受精的能力的特异性变化，例如顶体表面导致促进精子进入卵子的顶体酶释放的酶学变化。涉及到精子所用的术语“低温保护剂”是指在冻融周期中保护精子、提高存活及维持受精能力的分子。术语“稀释效应”是指在高度稀释时，精子运动性和/或存活力的迅速下降。此处所用术语“选择”是指基于有或无某种特殊性质而将样品细分的方法(如果没有其它上下文提示的话)。因此，“选定的精子样品”就是以某种特殊性质而对源样品进行选择所获得的样品。因此，相对源样品来说，选定的精子样品是对具有该特殊特征的精子的富集。此处所用术语“分类”描述了一种使用荧光激活细胞分类器(FACS)进行选择的方法。术语“增容剂(extender)”是指趋向于保护精子存活力的任何介质。术语“增容”是指用增容剂稀释精子。术语“初增容剂”是指在本专利技术方法的分离步骤之前，用于增容精子的介质。术语“终增容剂”是指在本专利技术方法的冷冻步骤之前，用于增容精子的介质。此处所述的增容剂中的“有机物质”是指趋向于减弱冷激并保护精子繁殖力的任何有机物质。此处所述的增容剂中的“能源”是指精子可以利用以进行细胞维护和/或运动性的任何物质或底物。此处所用术语“重量摩尔渗透压浓度(osmolality)”是指对水溶液中(例如增容剂)溶解的溶质颗粒的渗透压的测定。该溶质颗粒既包括离子又包括非离子化的分子。重量摩尔渗透压浓度以溶于1kg水的渗透活性颗粒的浓度(即渗透压摩尔)表示。低温贮藏方法本专利技术提供了一种低温贮藏选定的精子的方法，该方法包括以下步骤(a)获得选定的精子样品；(b)冷却所说的选定精子样品；(c)从所说的选定精子样品中分离精子；(d)向所说的分离的精子中添加终增容剂以产生精子悬浮液；及(e)冷冻所说的精子悬浮液。获得选定的精子样品本专利技术低温贮藏方法的第一步包括获得先前选定的精子样品，及将源样品用于任何适合的选择方法。任何物种的精子均可按本专利技术所述的方法进行选择和冷冻。该方法可以用驯养动物(尤其是牲畜)的精子，也可以用野生动物(例如，濒危物种)的精子进行。含哺乳动物精子的选定的精子样品为优选。人精子、牛、马、猪、绵羊、麇鹿和野牛的精子尤其优选。通常，选定的精子样品含有正常的、能存活的精子。为此，获得的射精物(由此获得精子)通常会有至少约50％、优选至少约75％形态正常的精子。在这些实施方案中，射精物中通常会有至少约40％、优选至少约60％的精子表现出渐进性运动性。可以使用各种选择细胞的方法从混合种群中进行选择，包括，例如基于细胞或细胞成分与抗体、抗体片断的结合或其它结合类型及微分染色所进行的选择。此处，用基于性别类型的选择方法对本专利技术进行了例证，并且用于本专利技术的性别选择的精子本文档来自技高网...

【技术保护点】
低温贮藏精子的方法，该方法包括：（ａ）获得选定的精子样品；（ｂ）冷却所说的选定精子样品；（ｃ）从所说的选定精子样品中分离精子以产生分离的精子；（ｄ）向所说的分离的精子中添加终增容剂以产生精子悬浮液；及（ｅ）冷冻所说的精子 悬浮液。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】...

【专利技术属性】
技术研发人员：约翰申克，
申请(专利权)人：XY公司，
类型：发明
国别省市：US[美国]