大豆过氧化物酶的制备方法技术

本发明专利技术公开了一种大豆过氧化物酶的制备方法，其分离纯化步骤如下：新鲜的大豆壳抽提液经高速离心，取上清液，用固体硫酸氨分级，沉淀；经ＤＥＡＥ－ＳｅｐｈａｄｅｘＡ－５０离子交换柱层析，Ｂｉｏ－ＧｅｌＰ－６０凝胶过滤，ＤＥＡＥ－ＳｅｐｈａｄｅｘＡ－２５二次离子交换和ＳｅｐｈａｄｅｘＧ－１００凝胶过滤、纯化，制得大豆过氧化物酶。该酶由一条多肽链组成，分子量约为３８，０００，酶的等电点为３．９，其ＲＺ＞２．８。该方法具有纯度高、活性高的特点，且离子交换柱和凝胶柱可多次使用，有效地降低了ＳＢＰ的制备成本。（*该技术在2022年保护过期，可自由使用*）

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及从大豆壳中提取过氧化物酶的方法，尤其涉及从大豆壳中提取和纯化大豆过氧化物酶(SBP，Soybean hull Peroxidase)的方法。过氧化物酶为一类有共同活性的酶，但并不都具有相同或相似的结构和作用机理。大多数过氧化物酶含Fe(III)-原卟啉IX辅基，属氧化血红素蛋白质。血红素(铁卟啉)的基本结构成分是由吡咯组成的卟吩，带上侧链后形成卟啉，再和一分子铁构成卟啉化合物即为血红素。有关血红素衍生物的变化均在卟啉环的侧链上进行。血红素作为过氧化物酶的辅基，在这类酶蛋白中是电子传递的载体。在过氧化物酶中，以辣根过氧化物酶(HRP，Horseradish Peroxidase)的结构和作用机理研究的比较透彻，在含铁过氧化物酶中也有代表性，它代表一大类非特异的过氧化物酶。HRP为结合了氧化血红素的糖蛋白。除铁外，每分子中还含有两个Ca2+。肽链由308个氨基酸残基组成。另有8个糖链(占分子量的18％)分别与13、57、158、186、198、214、255和268的Asp残基连接，他们分布在分子表面。大豆过氧化物酶(SBP)和辣根过氧化物酶(HRP)在一级结构上具有较大的类似性，共有123个不变的氨基酸残基，远端His42和近端His170(HRP)附近的氨基酸残基高度保守，分子内的二硫键数目和位置基本相同。虽然过氧化物酶价格昂贵，但仍在食品加工、日化、临床诊断等方面获得了广泛的应用。因此获得低廉的过氧化物酶产品具有重要的经济价值。大豆种皮是大豆加工过程中的废弃物，原料价廉易得，从其中提取SBP作为现在广泛应用的HRP的替代产品，具有重要的意义。SBP的提取及纯化方法，文献上鲜有报道。刘稳等人(刘稳，方靖，高培基。豆壳过氧化物酶的分离纯化及其性质研究。中国生物化学与分子生物学报，1998，14，577-582)曾利用亲和色谱法制备SBP，但柱子的寿命较短，制备SBP的成本太高。第六步取上述有酶活力的部分对pH4.5-6.0的20mmol/L醋酸缓冲液透析，浓缩。用同一缓冲液平衡DEAE-Sephadex A-25离子交换柱，然后，将浓缩液过柱，0-0.6mol/L NaCl梯度洗脱，测定280nm紫外吸收和酶活，收集有酶活的部分；第七步取上述有酶活力的部分对pH4.5-6.0的20mmol/L醋酸缓冲液透析，超滤浓缩，再经Sephadex G-100凝胶过滤，合并有酶活力的部分，制得大豆过氧化物酶，该酶由一条多肽链组成，分子量为38,000，酶的等电点为3.9，其RZ＞2.8；在上述制备大豆过氧化物酶的方法中，第四步、第五步和第六步的顺序可以颠倒。上述的20mmol/L磷酸缓冲液pH为6.8。上述的浸泡时间为12-15小时。上述的第二步中的滤液以6000转/分离心40分钟。上述的超滤浓缩是指用Amicon，PM10000的超滤膜超滤。上述的20mmol/L醋酸缓冲液pH为5.6。通过上述步骤制备的大豆过氧化物酶，经产品的纯度的检验、分子量的测定、酶的等电点、氨基酸组份分析、电子吸收光谱、大豆壳过氧化物酶活力的测定、酶的理化性质等实验的检测(见附图及实施例)，具有纯度高、活性高的特点，且离子交换柱和凝胶柱可多次使用，有效地降低了大豆过氧化物酶的制备成本。图2.活性组分的Sephadex G-100的凝胶色谱图。图3.SBP的等电聚焦IEF(Isoelectric focusing)图。条带1为SBP；条带2为pI标准物(戊基葡糖苷酶，3.50；甲基红，3.75；胰蛋白酶抑制剂，4.55；β-乳球蛋白A，5.20；碳酸酐酶B(牛)，5.85；碳酸酐酶B(人)，6.55；肌红蛋白酸带，6.85；肌红蛋白碱带，7.35；酸性晶状体凝集素，8.15；中性晶状体凝集素，8.45；碱性晶状体凝集素，8.65；胰蛋白酶原，9.30).图4.SBP的UV-VIS吸收光谱.图5.SBP的最适pH。图6.SBP的最适温度。图7.SBP的pH稳定性。图8.SBP的热稳定性。用Amicon，PM10000的超滤膜超滤浓缩至15mL，浓缩液经径高比1∶10，床体积为100cm3的Bio-Gel P-60凝胶过滤，测定酶活力，合并有酶活力的部分；第六步取上述有酶活力的部分对pH5.6的20mmol/L醋酸缓冲液透析，然后用Amicon，PM10000的超滤膜超滤，浓缩至15mL，用同一缓冲液平衡DEAE-Sephadex A-25离子交换柱，然后，将浓缩液经径高比1∶10，床体积为100cm3过柱，0-0.6mol/L NaCl梯度洗脱，测定280nm紫外吸收和酶活，收集有酶活的部分；第七步取上述有酶活力的部分对pH5.6的20mmol/L醋酸缓冲液透析，然后用Amicon，PM10000的超滤膜超滤，浓缩至10mL，浓缩液再经径高比1∶10，床体积为100cm3的Sephadex G-100凝胶过滤，合并有酶活力的部分，制得大豆过氧化物酶；(2)大豆过氧化物酶产品的检验1.纯度的检验聚丙烯酰胺凝胶电泳检测，确定酶的纯度。检验方法如下垂直板电泳分离胶浓度10％，3.5％的浓缩胶，SDS-不连续系统，电泳条件恒流，开始10mA，进入分离胶，改为25mA，电泳约8小时。考马斯亮兰R250染色。电泳图谱入附图说明图1。显示一条蛋白带。表明，SBP成分单一，不含多个同工酶组分。2.分子量的测定采取电泳和分子筛两种方法进行测定。垂直板电泳分离胶浓度10％，3.5％的浓缩胶，SDS-不连续系统，电泳条件恒流，开始10mA，进入分离胶，改为25mA，电泳约8小时。考马斯亮兰R250染色。结果见图1。电泳图谱中显示一条蛋白带。分子量为38,000。用Sephadex G-100凝胶过滤，从标准蛋白质分子量曲线求得酶的分子量。见图2。根据酶蛋白从Sephadex G-100的洗脱体积，按Andrews方法求得酶蛋白的分子量为39,500。两种测量结果表明，SBP分子由一条多肽链组成。分子量约为38,000。3.酶的等电点用等电聚焦IEF(Isoelectric focusing)电泳方法测酶等点电。胶浓度5.0％，胶厚1.5mm，内含0.8％载体两性电解质(pH3.5-10)，正极电泳液为1mol/L磷酸，负极为1mol/L NaOH溶液。电泳条件恒压200V，2小时后升压至400V，再2小时后升压800V，电泳至电流基本不再降低为止。考马斯亮兰R250染色。以LKB标准等电点Marker作参照。见图3。用IEF电泳测得酶的等点电为3.9，属于酸性蛋白质。4.氨基酸组份分析样品经5.7mol/L恒沸盐酸水解上氨基酸自动分析仪(Hitachi 835)测定，半胱氨酸核蛋氨酸残基以过甲酸氧化、色氨酸残基以碱水解后测定。结果见表1。氨基酸组成分析表明，SBP富含酸性氨基酸(Asx和Glx)，Asx、Glx约占氨基酸残基残基总量的26％，这与其等电点酸性相符合，Ser和Thr的含量也相当多。5.电子吸收光谱取纯化酶高蛋白组分，在UV-3100紫外可见分光光度计上进行230-700nm范围扫描，可得出图4。结果表明，此法获得的大豆壳过氧化物酶，其RZ大于2.8。从图4可以看出，此酶在404nm处有一典型的索尔(Soret)带，本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种大豆过氧化物酶的制备方法，其特征在于，按以下步骤进行：第一步：将新鲜的大豆壳按固液１∶５的比例浸泡于ｐＨ５－８的２０ｍｍｏｌ／Ｌ磷酸缓冲液中，以５０００－９０００转／分用组织捣碎器搅拌，０－４℃条件下浸泡１０－４８小时，过滤；第 二步：将上述滤液以５０００－１００００转／分离心３０－５０分钟，取上清液，加固体硫酸氨分级，沉淀；第三步：将３０％－８０％饱和度的沉淀对ｐＨ５－８的２０ｍｍｏｌ／Ｌ磷酸缓冲液透析，然后超滤浓缩；第四步：取上述浓缩液经ＤＥＡＥ－Ｓｅｐ ｈａｄｅｘ Ａ－５０离子交换柱层析，０－１．５ｍｏｌ／Ｌ ＮａＣｌ梯度洗脱，测定２８０ｎｍ紫外光吸收和酶活力，合并有酶活力的部分；第五步：取上述有酶活力的部分对ｐＨ５－８的２０ｍｍｏｌ／Ｌ磷酸缓冲液充分透析，超滤浓缩，经Ｂｉｏ－Ｇｅｌ Ｐ－６０凝胶过滤，测定酶活力，合并有酶活力的部分；第六步：取上述有酶活力的部分对ｐＨ４．５－６．０的２０ｍｍｏｌ／Ｌ醋酸缓冲液透析，浓缩。用同一缓冲液平衡ＤＥＡＥ－Ｓｅｐｈａｄｅｘ Ａ－２５离子交换柱，然后，将浓缩液过柱，０－０．６ｍｏ ｌ／Ｌ ＮａＣｌ梯度洗脱，测定２８０ｎｍ紫外吸收和酶活，收集有酶活的部分；第七步：取上述有酶活力的部分对ｐＨ４．５－６．０的２０ｍｍｏｌ／Ｌ醋酸缓冲液透析，浓缩，再经Ｓｅｐｈａｄｅｘ Ｇ－１００凝胶过滤，合并有酶活力的部分，制得大豆过氧 化物酶，该酶由一条多肽链组成，分子量为３８，０００，酶的等电点为３．９，其ＲＺ＞２．８；在上述制备大豆过氧化物酶的方法中，第四步、第五步和第六步的顺序可以颠倒。...

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：张为灿，刘稳，高培基，
申请(专利权)人：山东大学，
类型：发明
国别省市：88[中国|济南]