通过锚定于膜的gp41肽的表达进行HIV阳性病人的基因治疗制造技术

本发明专利技术涉及通过锚定于膜的ｇｐ４１肽的表达进行ＨＩＶ感染的基因工程治疗。用此治疗，第一次制造了编码一种包含由可弯曲的连接体连接的源于ＨＩＶｇｐ４１的肽和一种羧基末端跨膜锚的融合蛋白的载体。（*该技术在2020年保护过期，可自由使用*）

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】
本专利技术涉及通过锚定于膜的gp41肽的表达进行HIV感染的基因治疗。用此治疗，第一次制造了编码一种包含由可弯曲的连接体连接的源于HIV gp41的肽和一种羧基末端跨膜锚的融合蛋白的载体。已提出非常广泛多样的治疗方法来治疗HIV感染。然而，已有的活性物质已证实不被许多病人耐受。为了改进AIDS的治疗，正不断地寻找新的作用点和有不同毒性特征的活性物质。在此内容中，已提出不同的基因治疗方法，来抑制HIV复制中的不同步骤(参看SorgT.&Methali，M.Transfus.Sci.18，277-89(1977))。Wild等(Wild，C.T.Shugars，D.C.Greenwell，T.K..McDanal，C.B.&Matthews，T.J.Proc.Natl.Acad.Sci U.S.A.91，9770-9774(1994))已提出一种建立在以下发现基础上的治疗方法，即来源于HIV的跨膜蛋白gp41(参照对应于根据WIPO标准ST.254的数字代码<400>的序列编号4)的肽，比如，例如，以前称为DP178的T-20肽，能有效地抑制HIV融合和进入细胞。T-20是一种肽，与gp41的具有七个重复的C端，即gp41的细胞外区域中两个结构域(参照序列编号4中位置539-589和622-662)之一重叠，并且能够在体外有效地抑制HIV感染(Weissenhborn，W.，Dessen.，A.，Harrison，S.C.Skehel，J.J&Wiley，D.C.Nature 387，426-430(1997)；Chan，D.C.Fass，D.，Berger，J.M.&Kim，P.S.Cell 89.263-273(1997)；Furuta，R.A.，Wild，C.T.，Weng Y&Weiss，C.D.Nat.Struct.Biol.5，276-279(1998))。在一个临床研究(Kilby，J.M.，Hopkins S.，Venetta，T.M.等.Nat.Med.4，1302-1307(1998))中，就短期给药而言，T-20证实可安全和有效地抑制HIV复制。然而，为达到抗病毒效果，且如果口服肽不是生物可利用的，具有非常短的半衰期，则需要非常大量的肽，并且大规模的生产仍是非常昂贵的，因此本专利技术的目的是通过基因治疗方法使利用来源于gp41的肽进行细胞内免疫成为可能。本专利技术者因此首先克隆逆转录病毒载体MPIN的IRES-NEO盒(IRES内部核糖体进入位点；NEO新霉素抗性基因)5’端的T20的编码序列(参照附图说明图1，Hildinger et al.，Hum.Gene Ther.9(1998)33-42)。为达到T-20的分泌，一方面使肽在人低亲和力神经生长因子受体的信号肽(LNGFR，Fehse et al.，Human Gene Therapy 8(1997)1815)(构建体M85 and M86)后直接表达，另一方面选择一个构建体，其包含T-20框内的来源于Kaposi成纤维细胞生长因子的膜转运信号(mts)(在膜转运信号蛋白氨基酸位置43-58；Rojas，M.，Donahue，J.P.，Tan，Z.，Lin，Y.Z.Nat.Biotechnol.16，370-375(1998))的编码序列(参照图1中结构M89和M90)。使用这些构建体，逆转录病毒载体通过phoenix包装细胞(Grignani，F.，KINSELLA，t.，Mencarelli，A，等.，Cncer Res.58，14-19(1998))的转染产生，上清液被用来感染T辅助细胞系PM-1(Bou-habib，D.C.et al.，J.Virol.68 6006-6013(1994))。作为对照，使用MPIN载体，其专门包含新霉素抗性基因作为一种外来基因。在G418选择后，以HIV-1感染大量培养物，HIV-1产生自前病毒克隆NL4-3(Adachi，A.，GendelmanH.E.，Koenig，S.，Folks，T.，Willey，R.，Rabson，A.&Martin，M.A.，J.Virol.59 284-291(1986))或NL4-3/GFP(Welker，R.，Harris，M.，Cardel，B.&Krausslich，H.G.J.，Virol.72，8833-8840(1998))。这两种克隆的不同之处在于，就NL4-3/GFP而言，绿色荧光蛋白(GFP)取代nef蛋白表达，因此HIV-1复制能够在P24抗原产量基础上和/或通过流式细胞仪来分析。与所有的预期相比较，通过上述逆转录病毒载体构建体表达的T-20肽仍然令人吃惊地没有导致任何类型的抗病毒活性。一种编码在T-20编码区域框内的整联蛋白结合的RGD肽的序列被克隆进入这些构建体。这些构建体的产生是基于RGD基序能使分泌肽保持在细胞膜上的考虑。然而，即使产生了包含RGD的被分泌的T-20肽(参照图1，M86)，仍可发现能繁殖的HIV复制。在本专利技术的内容中，现在令人吃惊地确定P24的产量和NL4-3/GFP的传播能明显地减少，前提是融合蛋白被表达，这种融合蛋白除了氨基末端的gp41肽之外，包含通过一种可弯曲的连接体连接到羧基末端的跨膜锚。在本文，名词“gp41肽”意味着HIV的gp41蛋白的一个片段或它的一个片段，变异体或突变体。例如，已确定P24产量能被减少多于102，前提是PM-1由一种逆转录病毒载体转导，该载体表达一种融合蛋白，其中T-20通过一种可弯曲的肽连接体在C末端与一种跨膜肽(跨越膜的结构域，MSD)(参照图1，M87)连接，其中融合蛋白有序列编号2所指示的序列。本专利技术的对象因此是通式5’-SP-FI-铰合部-MSD-3’的核酸序列，其中“5表示核酸序列的5’端，“3表示核酸序列的3’端，“SP”编码信号肽，该信号肽介导一种被表达的肽转运进入内质网，“FI”编码HIV(优选HIV-1)的gp41蛋白的片段，它包含源于具有七个重复的区域的部分，“MSD”编码1型膜蛋白的跨膜锚，“铰合部”编码一种蛋白序列，其作为一种可弯曲的连接体，连接由“FI”和“MSD”编码的肽。编码信号肽的序列来源于人类非免疫原性蛋白的编码序列，优选地选自细胞膜蛋白信号肽，比如，例如(人)低亲和力神经生长因子受体(LNGFR)，白细胞介素2受体(IL-2R)以及粒细胞巨噬细胞集落刺激因子受体(GM-CSFR)的编码序列。作为1型膜蛋白(即N端定位在细胞外，C端定位在细胞内的膜蛋白)的跨膜锚，被使用的蛋白胞质区域应删除，避免任何不需要的通过蛋白信号转导。在预实验中，能够阐明没有信号转导作用从表达的区域发散，他们不与其他相似的膜蛋白寡聚化从而以这种方式对细胞功能发挥间接作用。优先考虑来自LNGFR或CD34的跨膜区的肽。核酸序列因此优选包括MSD，即一种编码这些跨膜锚的核酸序列和/或一种编码胞质区域被删除的片段的核酸序列。根据本专利技术，可以使用所有使gp41肽和跨膜锚间可弯曲的连接成为可能的可弯曲肽作为可弯曲的连接体本文档来自技高网...

【技术保护点】
核酸序列，以通式ＳＰ－ＦＩ－铰合部－ＭＳＤ为特征，其中“ＳＰ”编码信号肽，该信号肽介导一种表达的肽转运进入内质网，“ＦＩ”编码ＨＩＶ ｇｐ４１蛋白的片段，该片段包含一个来自于具有七个重复的区域的部分，“ＭＳＤ”编码１型膜蛋白的跨 膜锚，和“铰合部”编码一种蛋白序列，该蛋白序列作为一种可弯曲的连接体连接由“Ｔ２０”和“ＭＳＤ”编码的肽。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】...

【专利技术属性】
技术研发人员：MD冯莱尔，
申请(专利权)人：海因里希佩蒂协会，
类型：发明
国别省市：DE[德国]