一种新型鲑鱼降钙素类似物及其在植物油体中表达的方法技术

本发明专利技术采用基因工程技术，克隆了一种新型鲑鱼降钙素类似物的基因ｍｓＣＴ（３１ａａ），并建立了油体蛋白（ｏｌｅｏｓｉｎ）与目的蛋白融合的基因表达体系。其中包括：（１）分离和克隆了油菜油体蛋白基因的启动子及编码芝麻油体蛋白的结构基因；（２）设计合成了编码鲑鱼降钙素类似物ｍｓＣＴ［Ｔｒｐ＃＋［１］，Ｓｅｒ＃＋［６］，Ｐｈｅ＃＋［７］，ｄｅｌ－Ｌｅｕ＃＋［１９］］的基因ｍｓＣＴ，将其插在芝麻油体蛋白基因的Ｃ端；（３）构建了由油菜油体蛋白基因启动子驱动的芝麻油体蛋白－ｍｓＣＴ融合基因植物表达载体，分别用农杆菌法和花粉管通道法转化油菜和棉花，分别获得转基因植株及株系。（４）转基因油菜和棉花的分子生物学检测证明外源基因的整合和表达。本发明专利技术的新型降钙素类似物，其生物活性为６０００～８０００Ｕ／ｍｇ，远远超过天然鲑鱼降钙素４，５００Ｕ／ｍｇ和人降钙素１５０Ｕ／ｍｇ，该鲑鱼降钙素类似物具有降低血钙的作用，可用于治疗骨质疏松、Ｐａｇｅｔ′ｓ症、骨痛及各种高血钙症等。（*该技术在2021年保护过期，可自由使用*）

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及一种新型鲑鱼降钙素类似物msCT(31aa)及其在植物油体中表达的方法，具体地说涉及利用植物油体蛋白-目的蛋白组成融合蛋白基因表达体系生产鲑鱼降钙素类似物msCT(31aa)及其它目的蛋白的方法。用转基因植物生产医用蛋白或工业用酶，近年来受到人们的广泛关注。在植物油体中表达外源蛋白，目的基因插在油体蛋白(Oleosin)基因的C末端或N端，构成融合蛋白基因。由于Oleosin蛋白镶嵌在油体表面，融合蛋白基因在受体植物种子的油体中特异表达后，利用油体亲脂疏水的特性，将种子粉碎→液体抽提→离心，回收上层油相，即可将融合蛋白或目的蛋白与细胞内的其它组份分开，从而可明显简化目的蛋白的分离纯化过程。为完成本专利技术所涉及的油体表达系统的构建，本专利技术人首先分离、克隆了油菜油体蛋白基因的启动子、芝麻油体蛋白的结构基因以及鲑鱼降钙素的突变基因msCT，然后将msCT基因插在芝麻油体蛋白基因的C端，构建了由油菜油体蛋白基因的启动子驱动的融合蛋白基因植物表达载体，转化油菜和棉花，分别获得了转基因植株及株系。转基因油菜经PCR检测，证明降钙素基因已整合到油菜基因组中。转基因棉花经PCR-Southem和Western检测，证明msCT基因在棉花中整合并在油体中表达，目前已得到T2代转基因棉花株系44个。由于在田间对T1、T2代植株的叶片用高浓度(5000ppm)的卡那霉素(Kan)溶液涂抹，故筛选出的卡那霉素抗性(KanR)株理论上应为高表达的个体。天然鲑鱼降钙素的氨基酸序列如下Cys-Ser-Asn-Leu-Ser-Thr-Cys-Val-Leu-Gly-Lys-Leu-Ser-Gln-Glu-Leu-His-Lys-Leu-Gln-Thr-Tyr-Pro-Arg-Thr-Asn-Thr-Gly-Ser-Gly-Thr-Pro-NH2本专利技术人经广泛深入的研究，现已专利技术一种新型的鲑鱼降钙素类似物msCT，其氨基酸序列为Trp-Ser-Asn-Leu-Ser-Ser-Phe-Val-Leu-Gly-Lys-Leu-Ser-Gln-Glu-Leu-His-Lys-Gln-Thr-Tyr-Pro-Arg-Thr-Asn-Thr-Gly-Ser-Gly-Thr-Pro-NH2，即将天然鲑鱼降钙素的第1位氨基酸Cys突变为Trp，第6位的Thr突变为Ser，第7位的Cys突变为Phe，第19位的Leu缺失(其核苷酸序列见序列表序列标识符号3)。专利技术效果msCT与天然鲑鱼降钙素相比，第1、第6、第7、第19位的氨基酸均进行了改造，使其生物活性明显提高(6,000～8,000U/mg)，天然鲑鱼降钙素和人降钙素的生物活性分别为4,500和150U/mg。利用转基因植物在植物油体中表达鲑鱼降钙素类似物等外源目的蛋白，可以大大简化目的蛋白的分离纯化过程，降低生产成本；转基因植物的种子易于贮运，有利于工业化生产，并明显提高农副产品的附加值。附图简介附图说明图1是植物表达载体pNOC121的结构示意图。图2是pNOP载体的构建图。图3是pNOP的酶切鉴定图，其中1pNOP/HindIII+PstI双酶切；2λDNA/EcoRI+HindIII marker。图4是pSO载体的构建图。图5是pSO的酶切鉴定图，其中1λDNA/EcoRI+HindIIImarker；2pSO/PstI+BamHI双酶切。图6是pCT载体的构建图。图7是pCT的酶切鉴定图，其中1pBR322 DNA/BstNI marker；2pCT/BamHI+XhoI双酶切。图8是中间载体pNOPM的构建图。图9是pNOPM的酶切鉴定图，其中1pNOPM/HindIII+PstI双酶切；2λDNA/EcoRI+HindIII marker。图10是中间载体pNsOM的构建图。图11是pNsOM的酶切鉴定图，其中1λDNA/EcoRI+HindIIImarker；2pNsOM/PstI+BamHI双酶切。图12是中间载体pNOCM的构建图。图13是pNOCM的酶切鉴定图，其中1pNOCM/BamHI+XhoI双酶切；2λDNA/EcoRI+HindIII marker。图14是植物表达载体pNOC121的构建图。图15是pNOC121的酶切鉴定图，其中1λDNA/EcoRI+HindIIImarker2pNOC121/HindIII+EcoRI双酶切。图16是转基因油菜nptII的PCR检测，其中1λDNA/EcoRI+HindIII marker；2～5750bp PCR扩增的目的片段。图17是转基因油菜sOle/msCT的PCR检测，其中1～4577bpPCR扩增的目的片段；5λDNA/EcoRI+HindIII marker。图18是转基因棉花T1代的PCR-Southem杂交(nptII)，其中1～11、13～23、25～34为转基因棉花；12、24、36为λDNA/EcoRI+HindIIImarker；35为非转基因棉花对照。图19是转基因棉籽油体中油体蛋白-msCT融合蛋白的Western检测，其中1蛋白质分子量maker；2非转基因棉花对照；3转基因棉花株系351。图20是pEA结构图。图21是pMV结构图。下面是实现本专利技术的具体实施方式本研究中我们将鲑鱼降钙素基因msCT插入芝麻油体蛋白基因(sOle)的3’端，构建以油菜油体蛋白基因的启动子(NOP)驱动的sOle/msCT融合蛋白基因的植物表达载体pNOC121。pNOC121结构示意图见图1。实施例1油菜油体蛋白基因启动子的PCR扩增和克隆由于油菜是我国重要的大宗油料作物，含油量高(42～45％)，而且油菜油体中20kD油体蛋白的量为24kD油体蛋白量的10倍，所以我们根据20kD油体蛋白基因启动子的序列设计了引物NP5、NP3，其序列如下NP5ATTCAAGCTTGTCGGATCATGACGTTTCCAGNP3GCTTCTGCAGAATTGAGAGAGATCGAAGAG以白菜型油菜(B.campestris)青油14品种的总DNA为模板，PCR扩增了896bp的20KD oleosin基因的启动子(PCR反应条件为94℃ 30秒，58℃ 30秒，72℃ 1分钟，35个循环结束后72℃延伸10分钟)，用HindIII+PstI双酶切将其连接到pUC19上，得到pNOP。pNOP载体的构建过程和酶切鉴定分别见图2、3。pNOP测序结果表明，克隆产物为896bp油菜油体蛋白基因的启动子(见序列表序列标识符号1)。实施例2芝麻油体蛋白基因的扩增和克隆以带有芝麻油体蛋白基因的质粒pEA(图20)DNA为模板，设计引物Ole5、Ole3，其序列如下Ole5GTGCTGCAGACAACAATGGCGGACGAACCCCACGOle3AAAGGATCCCGGTCTTATTACATCTTGGCTTCPCR扩增获得440 bp不含终止子序列的芝麻油体蛋白基因。PCR反应条件为94℃ 30秒，52℃ 30秒，72℃ 1分钟，35个循环结束后72℃延伸10分钟。PCR产物用PstI/BamHI双酶切，连接到载体pUC19上，获得克隆载体pSO。pSO的载体构建、酶切鉴定分别见图4、5。其序列见序列表本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种编码鲑鱼降钙素类似物ｍｓＣＴ（３１ａａ）的基因ｍｓＣＴ［Ｔｒｐ↑［１］，Ｓｅｒ↑［６］，Ｐｈｅ↑［７］，ｄｅｌ－Ｌｅｕ↑［１９］］，其编码产物的氨基酸序列结构为：Ｔｒｐ－Ｓｅｒ－Ａｓｎ－Ｌｅｕ－Ｓｅｒ－Ｓｅｒ－Ｐｈｅ－Ｖａｌ－Ｌｅｕ－Ｇｌｙ－Ｌｙｓ－Ｌｅｕ－Ｓｅｒ－Ｇｌｎ－Ｇｌｕ－Ｌｅｕ－Ｈｉｓ－Ｌｙｓ－Ｇｌｎ－Ｔｈｒ－Ｔｙｒ－Ｐｒｏ－Ａｒｇ－Ｔｈｒ－Ａｓｎ－Ｔｈｒ－Ｇｌｙ－Ｓｅｒ－Ｇｌｙ－Ｔｈｒ－Ｐｒｏ－ＮＨ↓［２］，即将天然鲑鱼降钙素的第１位氨基酸Ｃｙｓ突变为Ｔｒｐ，第６位的Ｔｈｒ突变为Ｓｅｒ，第７位的Ｃｙｓ突变为Ｐｈｅ，第１９位的Ｌｅｕ缺失。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：贾士荣，刘昱辉，
申请(专利权)人：中国农业科学院生物技术研究所，
类型：发明
国别省市：11[中国|北京]