植物病毒卫星DNAβ分子、侵染性克隆及表达载体制备方法技术

一种植物病毒卫星ＤＮＡβ分子，其特征在于，它是一种单链环状ＤＮＡ分子，全序列大小为ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．１ １３４８ｂｐ。（*该技术在2022年保护过期，可自由使用*）

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】
本专利技术涉及基因工程领域，具体地，本专利技术涉及一种。更具体地说，本专利技术涉及一类粉虱传双生病毒赛葵黄脉病毒(Malvastrum coromandelisnum yellow vein virus，MYVV)卫星DNAβ及其全基因组序列。本专利技术还涉及一种新型的植物DNA侵染性克隆，具体地说，涉及粉虱传双生病毒赛葵黄脉病毒的侵染性克隆，本专利技术还涉及利用该侵染性克隆进行病毒功能基因组研究的方法。本专利技术还涉及一种植物DNA病毒的表达载体及其制备方法，具体地说，涉及粉虱传双生病毒赛葵黄脉病毒卫星DNAβ的表达载体及其制备方法。
技术介绍
粉虱传双生病毒(whitefly-transmitted geminivirus，WTG)是世界范围内广泛发生的一类植物单链DNA病毒，近年来已在热带、亚热带地区多种作物上引起严重危害，给作物生产造成了严重损失。WTG在分类上属于双生病毒科(Geminiviridae)中的菜豆金黄花叶病毒属(Begomovirus)病毒，包括100多个独立种。在自然条件下，WTG均由烟粉虱(Bemisia tabaci)传播，其病毒粒子形态为孪生颗粒状，大小18×30nm，基因组为单链环状DNA，大小2.5-3.0kb。大多WTG病毒包含2个大小相近的DNA组份，称DNA-A和DNA-B。DNA-A和DNA-B大部分序列不同，但在非编码区中有约200个核苷酸序列几乎相同(同源性大于95％)，称为共同区(common region，CR)，共同区包含病毒复制、转录起始和包装所需的序列，并有茎环结构。DNA-A编码病毒复制所必须的复制相关蛋白(Rep)、复制增强蛋白(Ren)、外壳蛋白(CP)和控制晚期基因表达的转录激活蛋白(TrAP)，与病毒的复制和介体传播有关；DNA-B编码一个核穿梭蛋白(NSP)和一个运动蛋白(MP)，与病毒在植物体内的运输和病毒的寄主范围有关。少数WTG病毒，基因组只含单条DNA分子，即DNA-A，长为2.8kb，编码6个ORFs。一般，单组份WTG病毒如胜红蓟黄脉病毒(AYVV)，单单DNA-A接种寄主胜红蓟，不能形成典型的黄脉症状，若与发现的新型DNAβ分子共同接种，才能引起典型的黄脉症状。DNAβ是一种包裹在双生病毒粒子中、可由烟粉虱传播的单链环状DNA分子，大小为DNA-A的一半，除茎环结构SEQ ID NO.1外，与病毒基因组DNA-A和DNA-B序列均无同源性，其复制、包装、移动、介体传播等都依赖DNA-A，但与病状形成相关。本专利技术在单组份中国赛葵黄脉病毒上发现了一种新型的DNA卫星分子。植物病毒侵染性载体的获得是研究病毒功能基因组的前提，在分子生物学水平上研究病毒基因组结构与功能以及寄主与病毒之间的互作，必须先要获得病毒的侵染性克隆，进而利用DNA重组技术进行突变，缺失，插入，置换以及互补实验对病毒基因组进行功能区域的定位和研究。该技术是深入研究病毒的基因功能以及病毒与寄主植物互作的有效手段。植物DNA病毒的侵染性克隆是1982年在番茄金花叶病毒(TGMV)上首先构建成功的。虽然该技术产生较晚，但是发展却极为迅速，现已广泛应用于病毒的遗传表达和复制分析。本专利技术在获得新型卫星DNAβ分子的基础上，构建了该卫星DNAβ分子的侵染性克隆，以应用于病毒的功能基因组研究。以植物病毒的基因组为载体表达外源基因，这是一种具有广泛应用前景的植物生物反应器。植物具有合成、折叠、翻译后修饰及装配蛋白的机制，外源蛋白在植物体内可以大量繁殖，因此可以利用植物进行大量地、廉价地生产重要药用蛋白(特别是疫苗)。利用植物生产药物主要有两种方法(1)外源基因暂时存在于植物细胞中(如利用植物病毒载体)，植物可表达由外源基因编码的蛋白质；(2)外源基因长期存在于植物细胞中，即导入的外源基因将成为植物基因组的一部分，然后持续不断地产生由外源基因编码的蛋白质。转基因植物中外源基因的表达量都比较低，一般在可溶性蛋白的1％以下，而且基因转化和植株再生过程费力费时，这在很大程度上影响了利用转基因植物生产药用蛋白的全面产业化进程。植物病毒一般都具有很强的繁殖能力，基于植物病毒的这一特性，从80年代起，世界各地的研究人员就开始探索利用植物病毒载体高效表达外源基因的可行性，并成功地表达了多种蛋白。本专利技术在构建好的侵染性克隆的基础上，构建了一种利用植物DNA病毒的表达载体。
技术实现思路
本专利技术的一个目的是提供一种植物病毒卫星DNAβ分子，该卫星DNA分子是与单组份双生病毒相伴随的卫星分子。本专利技术的另一个目的是提供一种植物病毒及其卫星的侵染性克隆。本专利技术的另一个目的是提供一种持续、稳定、高效的植物表达载体制备方法。本专利技术的一个方面是提供一种新型植物病毒卫星DNAβ分子，它是一种单链环状DNA分子，全序列大小为SEQ ID NO.1 1348bp，互补链编码一个功能未知蛋白，还含SEQ ID NO.2的九核苷酸序列TAATATTAC。本专利技术的另一个方面是提供一种侵染性克隆，即赛葵黄脉病毒的侵染性克隆，该侵染性克隆接种寄主植物，DNA-A能够系统侵染，但只有DNA-A加上DNAβ才能引发典型的症状。本专利技术的另一个方面是提供一种以植物为生物反应器的表达载体，它以赛葵黄脉病毒卫星DNAβ作为外源基因的表达载体，通过构建含外源基因的重组卫星DNA，接种植物并表达外源基因，或接种植物组织、植物细胞培养物，在组织培养条件下表达外源基因。本专利技术的再一个方面是提供一种根据赛葵黄脉病毒卫星DNAβ分子构建的表达载体制备方法，该方法包括a.将1.4个拷贝正向重复的DNA-A构建至植物表达载体；b.将两个拷贝正向重复的DNA-β构建至植物表达载体；c.把a和b中构建的载体导入农杆菌宿主；d.将c中构建的农杆菌注射接种寄主植物；e.观察症状及分子水平的检测。本专利技术的优点1)植物病毒只侵染植物不感染动物和人，相对安全；2)双生病毒增殖速度快，在植株体内拷贝数高，能快速高效地表达外源基因，通常在接种2周后外源基因就可达到最大量的积累；3)双生病毒为DNA病毒，且基因组小，可直接在体外进行遗传操作，即便利又降低了成本；4)该表达载体中卫星不会破坏辅助病毒的复制体系的完整性，且卫星与辅助病毒DNA序列无同源性，不会因同源重组而导致外源基因的丢失，可持续高效地表达不同的外源蛋白。5)该表达载体进入植物细胞中，只作瞬间的基因表达，病毒DNA不能整合到宿主细胞组中，因而不会产生类似转基因植物可能产生的安全性问题；6)该表达载体采用农杆菌针刺接种植物，对设备要求低，而发病率可达100％，因而简便高效；7)该表达系统为真核表达系统，能对真核蛋白质进行准确的翻译后加工修饰。具体实施例方式实施例1 赛葵黄脉病毒DNAβ组分基因组全序列的克隆和测定1.植物总DNA的抽提称取0.5-1g叶片，加液氮研磨至粉末状，加入15ml抽提缓冲液(100mMTris·HCL pH8.0，50mM EDTA pH8.0，500mM NaCl，临用前加入β-巯基乙醇2.3μl/ml)，继续研磨，转移至50ml离心管，所有样品保持在4℃。加入1ml 20％SDS，温和地颠倒混匀，65℃温浴10min.加入5ml 5M KAC，温和地颠倒混匀，冰上放置20分钟，4000r本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】

【专利技术属性】
技术研发人员：周雪平，谢艳，崔晓峰，陶小荣，李正和，
申请(专利权)人：浙江大学，
类型：发明
国别省市：