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霍乱毒素B亚基的制法制造技术

技术编号:1724875 阅读:173 留言:0更新日期:2012-04-11 18:40
本发明专利技术公开了一种霍乱毒素B亚基的制法,属于生物技术制药工程中的基因工程生产多肽类药物技术领域。该方法通过家蚕杆状病毒表达系统(Bombyx mori Nuclear polyhedrosis Virus)重组带有CTB基因,获得重组病毒,该病毒已提交中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保存,地址在北京中关村,保藏日期为2001年7月2日,保藏编号为CGMCC NO:0594,将该重组病毒接种家蚕幼虫、蛹进行表达,经分离纯化,冷冻干燥,制成口服药物,经动物试验,在小鼠体内产生较强的抗体;以家蚕幼虫、蛹中表达CTB作为佐剂能显著增强rHBsAg、丙肝抗原、IBDV VP2抗原的口服免疫效果,显著增强胰岛素、rhGM-SCF口服治疗效果,成为一种制备抗霍乱菌药物和佐剂的新型方法。与现有技术相比,原料易得,生产成本低,治疗效果良好,具有十分重大的市场开发应用前景。(*该技术在2021年保护过期,可自由使用*)

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及通过家蚕杆状病毒表达系统用蚕幼虫和蛹制备霍乱毒素B亚基(CTB)蛋白的方法,本专利技术还涉及用蚕幼虫和蛹生产CTB制备药物的方法。用大肠杆菌系统可以表达CTB蛋白,且表达量较高,但不含糖基化,并形成包涵体,涉及到蛋白质变性和复性问题,给后处理工艺带来繁琐的多步操作;用哺乳动物细胞可以生产CTB蛋白,但需要培养基和牛血清来培养,生产成本高,另外表达低也是一个问题。家蚕杆状病毒表达系统(Bombyx mori Nuclear polyhedrosis Virus)是真核表达系统,该技术自1983年Smith等首创以来,已有百种外源基因在该系统表达(《昆虫病毒分子生物学》,1998,547-578),由于家蚕淋巴血本身的大量蛋白的保护作用和一些未知机理的作用,家蚕表达的蛋白可以生产口服药物。本专利技术提供了含有霍乱毒素B亚基(CTB)的大肠杆菌质粒pUC-CTB,以霍乱菌基因组DNA为模板,通过PCR扩增,在5’端引物引进BamHI酶切位点,在3’端引入靶向序列和EcoRI位点,PCR产物经Klenow酶补平克隆进入pUC19的SmaI位点(宝灵曼公司),构建质粒pUC-CTB。本专利技术还提供了含CTB基因的杆状病毒转移质粒pBac-CTB。从pUC-CTB质粒用BamHI和EcoRI酶切,将目的片段连在同样被BamHI和EcoRI酶切的pBacPAK8上(CLONTECH公司),构建含CTB基因的杆状病毒转移质粒pBac-CTB(附图说明图1)。本专利技术还提供了含CTB基因的重组家蚕杆状病毒BmBacCTB。将转移质粒pBac-CTB与家蚕核型多角体病毒DNA进行共转染家蚕(Bombyx mori)细胞BmN,进行10轮空斑和Southern点杂交筛选筛选出含CTB基因的重组昆虫杆状病毒BmBacCTB,该病毒分类命名为杆状病毒属家蚕核型多角体病毒(含CTB),该病毒已提交中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保存,地址在北京市中关村,保藏日期为2001年7月2日,保藏编号为CGMCCNO0594。本专利技术还提供了CTB基因在家蚕五龄幼虫和蛹中的表达产物。将重组杆状病毒BmBac CTB注射到五龄家蚕幼虫和蛹(Bombyx mori)(申请人自行饲养)中,每头注射2ul左右(滴度为1×107/ml),分别取24、48、72、96和120小时表达的家蚕淋巴血,经SDS-PAGE电泳和Western杂交结果表明,条带分子量为50KD左右。ELASA检测表明感染后第120小时每条蚕平均表达量为0.52mg,感染后第120小时每个蛹平均表达量为0.53mg(图2)。本专利技术还提供了对家蚕幼虫表达的CTB进行纯化。发病5天后收集蚕血清先经离心和硫酸铵沉淀后上Sephadex G150柱和MonoQ柱分离,每次收集样品均经测活,确定其活性存在,进一步用HPLC阳离子交换柱和阴离子交换柱纯化,获得纯度为95%的重组蛋白。本专利技术还将家蚕幼虫和蛹体表达CTB制成口服药物。在家蚕幼虫、蛹中表达CTB能显著增强IBDV VP2口服免疫效果。本专利技术还进行了家蚕幼虫、蛹中表达CTB作为佐剂的抗丙肝病毒的动物免疫实验。实验动物为BalB/C小鼠,共60只,随机分成3组,每组20只,I组每只经口喂丙肝抗原口服药物(申请者表达,参考)加上15ug CTB(实例6),II组每只经口喂丙肝抗原口服药物,对照组为0.9%生理盐水,共免疫3次,间隔7天。4周后每隔1周采血。结果表明I组小鼠个体80%以上5周后均产生了较强的抗体水平,I组到第8周血清抗体OD水平已达到1.2,相当于丙肝感染者的抗体水平,比II组血清抗体水平增加1倍以上,表明家蚕幼虫、蛹中表达CTB能增强丙肝抗原口服免疫效果。本专利技术还进行了家蚕幼虫、蛹中表达CTB作为佐剂的NOD小鼠模型抗I型糖尿病的动物实验。实验动物为NOD小鼠,共20只,随机分成2组,每组10只,I组每只经口喂100ug胰岛素(购自Novo公司)加上15ug CTB(实例6),II组每只经口喂100ug胰岛素。共免疫7次,间隔7天。结果表明20周后I组小鼠胰腺炎指数为2.0+0.3,II组小鼠胰腺炎为4.0+0.5,30周后II组有75%小鼠发生糖尿病,而I组小鼠只有35%发生糖尿病,说明以家蚕幼虫、蛹中表达CTB作为佐剂的胰岛素口服免疫能显著抑制NOD小鼠模型糖尿病的发生。本专利技术还进行了家蚕幼虫、蛹中表达CTB作为佐剂的小鼠升白细胞的动物实验。实验动物为BalB/C小鼠,共100只,随机分成2组,每组50只,I组每只经口喂10ug rhGM-SCF(先灵保雅公司产品)加上10ug CTB(实例6),II组每只经口喂10ug rhGM-SCF(先灵保雅公司产品)。结果表明I组喂小鼠喂药3天后白细胞开始增加,1周后白细胞增加13%,II组小鼠白细胞变化不明显,表明家蚕幼虫、蛹中表达的CTB能增强rhGM-SCF口服生白细胞效果。本专利技术还对用家蚕幼虫、蚕蛹表达的CTB进行抗霍乱菌的动物实验。实验动物为BalB/C小鼠30只,随机分成3组,每组10只。I组每只经口喂50ug CTB药物,II组每只经口喂10ug CTB药物,对照组为0.9%生理盐水,共免疫3次,间隔7天。4周后采血,用CTB抗体检测试剂盒(Sigma公司)检测结果,结果表明I组小鼠均产生了较强的抗体水平,到第8周血清抗体OD水平已达到1.0以上,相当于患者感染者的抗体水平,说明家蚕幼虫、蛹中表达CTB口服后能在体内产生较强的抗体。综上所述,本专利技术的优点如下用蚕高效表达CTB,可以避免直接从动物体内纯化存在的操作烦琐、产率底、生产成本高等缺点,不会造成公害;家蚕是可以无菌大规模饲养经济昆虫,可以低成本地大规模饲养;蚕体中有多种天然蛋白质保护剂,对表达产物有保护作用,使基因表达产物十分稳定;家蚕生产的蛋白可以口服药物,为患者解除了注射的痛苦和被感染的威胁。用家蚕幼虫和蚕蛹表达的CTB药物作为佐剂也具有较好的效果本专利技术还进行了用家蚕幼虫和蚕蛹表达的CTB药物作为佐剂的抗乙肝病毒的动物免疫实验。实验动物为BalB/C小鼠,购自浙江医学科学院动物中心,共60只,平均体重16~18g,随机分成3组,每组20只,I组每只经口喂100ug rHBsAg(购自中国药品生物制品鉴定所)加上15ug CTB(实例6),II组每只经口喂100ugrHBsAg,对照组为0.9%生理盐水,共免疫3次,间隔7天。4周后每隔1周采血检测结果。结果表明I组小鼠个体80%以上4周后均产生了较强的抗体水平,到第8周血清抗体水平已大到205mIU/ml,说明基于在家蚕幼虫、蛹中表达CTB作为佐剂的rHBsAg口服免疫能在体内产生较强的抗体,产生了免疫应答。本专利技术还进行了家蚕幼虫、蛹中表达CTB作为佐剂的抗传染性法氏囊病病毒(IBDV)的动物免疫实验。实验动物为非免疫鸡,共40只,随机分成2组,每组20只,I组每只经口喂10mg IBDV VP2冻干粉(申请者表达,参考《生物化学和生物物理学报》,2000年第3期,281-284页)加上10ug CTB(实例6),II组每只经口喂15mg IBDV VP2冻干粉(来源同上),共免疫5次,间隔3天。3周后每隔1周采血检测中本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种霍乱毒素B亚基的制法,其特征在于:通过基因工程方法获得重组的带CTB基因的家蚕重组杆状病毒,该病毒分类命名为:杆状病毒属家蚕核型多角体病毒(含CTB),该病毒已提交中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保存,址址在北京中关村,保藏日期为2001年7月2日,保藏编号为CGMCCNO:0594,并用该病毒接种家蚕幼虫和蛹进行表达CTB。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员:金勇丰张耀洲吴祥甫
申请(专利权)人:浙江大学
类型:发明
国别省市:86[中国|杭州]

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