一种重组人胸腺肽β4Y及其制备方法和用途技术

本发明专利技术涉及一种重组人胸腺肽β４Ｙ（以下简称人Ｔβ４Ｙ），其的制备方法，特别是用原核宿主细胞制备重组人胸腺肽β４Ｙ的制备方法，以及该重组人胸腺肽β４Ｙ的用途。所制备的重组的胸腺肽β４Ｙ活性多肽具有促进血管生成和促进人血管内皮细胞迁移的功能，是可用于制备促进创伤愈合的药物组合物类药物。（*该技术在2021年保护过期，可自由使用*）

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及一种重组人胸腺肽β4Y(以下简称人Tβ4Y)，其的制备方法，特别是用原核宿主细胞制备重组人胸腺肽β4Y的制备方法，以及该重组人胸腺肽β4Y的用途。由本专利技术方法所制备的重组人胸腺肽β4Y具有促进血管生成和促进人血管内皮细胞迁移的功能，是可用于制备高效促进创伤愈合的药物组合物类药物。创伤愈合是健康保障中的一个重要问题。在创伤修复过程中一个核心问题是损伤组织的血管再生。一般说来，创伤发生的同时，体内的修复机制随即启动。创伤修复的基本步骤是微血管形成，即在已有的血管基础上形成新的微血管。这个过程必须有足够的营养和氧的支持，以保证参与修复的细胞能在短时间内，除去坏死的细胞，形成新的肉芽。然而，微血管的形成只是体内对创伤的即时反应，是一个创伤愈合的过渡状态。一般的创伤条件下，血管可在创伤后两天内形成，然后，随着伤口的愈合，血管会逐渐地萎缩消失。但是，就创伤修复的分子机制而言，人体内究竟是哪些因子参与了对血管再生和血管退化的启动和调节我们还知之甚少。目前，已知若干促血管再生的生长因子，诸如血小板起源生长因子(PDGF)、血管上皮生长因子(VEGF)、角化细胞生长因子(KGF)，纤维源生长因子(FGF)，内皮细胞生长因子(EGF)和胸腺肽等等，都可以在伤口渗液中检测得到。尽管，它们参与修复的机理还待进一步研究，但是其在伤口愈合中起的生理作用却是被许多实验所证实。胸腺肽(Thymosin)是一种在高等真核生物中非常普遍存在的多肽物质，可根据等电点(pI)划分为三类胸腺肽α(pI低于PH5.0)，胸腺肽β(pI介于PH5.0-7.0)，胸腺肽γ(pI高于PH7.0)(Low等，生物化学杂志(J.Biol.Chem)，254981，1979)。Tβ是一组分子量约为5kDa的极端保守的极性多肽，目前已知的家族成员有15种，由40-44个氨基酸组成。Tβ广泛存在于脊椎动物和无脊椎动物之中(Nachmias，细胞生物学(Cell.Biol)，556，1993)。在大多数哺乳动物组织中，Tβ4是Tβ的主要存在形式。其在组织和细胞中分布极广而且浓度很高，占Tβ总含量的70-80％。对Tβ的研究主要集中在Tβ4上。Tβ4在细胞内是主要的肌动蛋白调节肽，它以1∶1的比例与肌动蛋白单体结合，阻止纤维状肌动蛋白聚合体的形成，因此，可作为一个肌动蛋白单体的调节器。Tβ4在G-actin和F-actin两种形式的转化中也具有调节作用。(Safer等，生物短评(Bioessays)16473，1994)Tβ4具有多种生理功能1)诱导金属蛋白酶；2)促进血管发生；3)抑制炎症；4)抑制骨髓瘤细胞增生；5)影响T淋巴细胞分化；6)影响下丘脑和垂体；7)刺激人体血管内皮细胞迁移(Huff等，细胞生物学生物化学杂志(J.Biochem.Cell.Biol)33205，2001)。Tβ4在血小板中浓度高达200-500uM，在创伤组织液中浓度高达13ug/ml。虽然目前尚不清楚其分子机制(Safer等，美国国家科学院院报(PNAS.USA)，872536，1990)，实验证明Tβ4能促进创伤愈合，是与其促血管发生和刺激人体血管内皮细胞迁移有关。一般认为人体内有三种TβTβ4，Tβ10，和Tβ15。然而，1997年Lahn和Page在进行人类Y染色体基因组研究时，首次发现了另外一种Tβ基因(科学，Science，278675，1997)。这个称为Tβ4Y的基因具有与其他Tβ不同的两个特征，1)Tβ4Y是一个伴性基因，仅位于Y染色体上，而其他的Tβ则不是。例如，Tβ4就在七个染色体上有其位置。2)在氨基酸组成上，Tβ4Y与Tβ4有较高的同源性(90％)，与Tβ10和Tβ15的同源性较差(70％)。但是，在等电点上，Tβ4Y与Tβ10和Tβ15相当接近(～5.3)，与Tβ4(5.0)相去较远。对于Tβ4Y的研究还在非常初级阶段。迄今，尚未见任何从人体内提纯Tβ4Y或用抗体法鉴定Tβ4Y的报道。除了我们实验室之外，也未见其他同行从事它的体外表达和生理功用的研究。由于人源Tβ4来源的局限性，更限于小分子量的多肽纯化，在技术上要求较高，且纯度和回收率不佳。目前Tβ4主要以从其它动物组织中提取的Tβ4为人源Tβ4的替代品，或者人工合成该功能肽。本专利技术的目的是在原核及真核表达系统中，将人Tβ4Y以融合蛋白或非融合蛋白的形式克隆与表达，并以融合蛋白中的Tag部分作为特异纯化的标记，对融合蛋白加以分离纯化。对其促进创伤愈合的活性进行鉴定。目前，市场上医用Tβ4的来源主要是组织提取和人工合成的产物，尚未有基因工程重组形式的产品。至今为止，已有21篇美国专利与“胸腺肽”和“创伤愈合”有关，其中只有一篇关于胸腺肽α1(thymosin alpha1)的专利(Malinda等。US6197751，03/6/2001)与组织修复、血管生成和细胞移动有关。在加拿大有一份胸腺肽的专利(Goldstein等，申请号CA 2338928，07/29/1999)，该专利涉及到了Tβ4，Tβ10，和Tβ15的保护，但与Tβ4Y无关。本专利技术人从人类基因组的BAC库中克隆得到人Tβ4Y基因，并将其以GST或(His)6融合蛋白的形式在原核宿主中表达出来。我们首次对Tβ4Y的体外和体内的生理功能进行了测定。实验表明，1)重组的Tβ4Y具备一般Tβ4的生物活性，对创伤修复有显著的促进作用；2)重组的Tβ4Y带有GST或His标记，因此极大地简化了蛋白质纯化的工艺，而且，重组蛋白质的纯度比天然物提取的产物要高；3)重组的Tβ4Y可在原核细胞中高度表达，极大地降低其生产成本。序列图说明SEQ ID No.1 人Tβ4Y的核苷酸序列SEQ ID No.2 人Tβ4Y的氨基酸序列专利技术详述本专利技术的第一个方面包括了一种重组胸腺肽β4Y(Tβ4Y)活性多肽，其由包含SEQ.ID No.1所示的人胸腺肽β4Y活性多肽的核苷酸序列或其取代、插入、缺失突变序列的多核苷酸编码编码，只要编码的多肽仍具有胸腺肽β4Y活性或对人体无免疫原性。在本专利技术的一个实施方案中，所述的重组胸腺肽β4Y(Tβ4Y)活性多肽，其具有SEQ.ID No.2所示的氨基酸序列。本专利技术又一方面包括一种制备本专利技术所述的重组胸腺肽β4Y(Tβ4Y)活性多肽的方法，其包括(1)用含有SEQ.ID No.1所示的人胸腺肽β4Y活性多肽的核苷酸序列或其取代、插入、缺失突变序列的基因转化大肠杆菌，只要编码的多肽仍具有胸腺肽β4Y活性或对人体无免疫原性；(2)从经培养的重组大肠杆菌细胞和/或培养液中提纯重组胸腺肽β4Y活性多肽。在本专利技术的一个实施方案中，本专利技术的重组胸腺肽β4Y活性多肽制备方法中所述重组胸腺肽β4Y活性多肽为融合蛋白。本专利技术又一个实施方案中，本专利技术的重组胸腺肽β4Y活性多肽制备方法中所述重组胸腺肽β4Y活性多肽为非融合蛋白。由本专利技术所制备的重组的胸腺肽β4Y活性多肽具有促进血管生成和促进人血管内皮细胞迁移的功能，是可用于制备促进创伤愈合的药物组合物类药物。此处所用术语“活性”是指由促进人血管内皮细胞迁移和促进血管生成作用而引起的促进创伤愈合的活性。为实现本专利技术所述的诱导表达，所选表达系统一般包括带有适当的严紧诱导型启本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种重组胸腺肽β４Ｙ（Ｔβ４Ｙ）活性多肽，其由包含ＳＥＱ．ＩＤ Ｎｏ．１所示的人胸腺肽β４Ｙ活性多肽的核苷酸序列或其取代、插入、缺失突变序列的多核苷酸编码编码，只要编码的多肽仍具有胸腺肽β４Ｙ活性或对人体无免疫原性。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：鄂亚平，高玉，冯小黎，周征锋，李斐斐，刘斯奇，汪建，
申请(专利权)人：北京华大基因研究中心，
类型：发明
国别省市：11[中国|北京]