合成gagpo1基因及其用途制造技术

本发明专利技术涉及合成ｇａｇ和ｇａｇｐｏｌ基因，其经密码子最优化以达到最优化的高水平表达；及其对于载体颗粒有效产生之用途。本发明专利技术还涉及包装细胞的产生及以该合成ｇａｇ和ｇａｇｐｏｌ基因为基础的疫苗。（*该技术在2021年保护过期，可自由使用*）

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】专利技术说明本专利技术涉及合成gag和gagpol基因，其经密码子最优化以达到最优化的高水平表达；及其对于载体颗粒有效产生之用途。本专利技术还涉及包装细胞的产生及以该合成gag和gagpol基因为基础的疫苗。基因治疗所用以反转录病毒为基础之载体粒子，疫苗接种所用以反转录病毒为基础的病毒样颗粒(virus-like particle)(VLP)或DNA疫苗接种所用以反转录病毒为基础的DNA或RNA构建体应该需要有以高产率表达出结构基因和酶功能之能力以期得到最大的效率，且又要同时具有对接受者最低可能的危险和副作用。使用复杂的类反转录病毒HTLV-1和-2，慢病毒(Lentiviruses)和泡沫病毒(Spumaviruses)要能有效率地产生结构蛋白质或酶型蛋白质之举会受到彼等病毒对转录，细胞核RNA转位(translocation)和表达等的复杂调节机制所限制。例如，SIV和HLV-1晚期基因产物的表达即因此依早期蛋白质如Tat和Rev的存在和功能而在转录和后-转录层次受到高度调节。即使Tat的抗-阻遏物(anti-repressor)功能可经由使用通过病毒及/或细胞启动子/增强子单位的异源转录控制而容易地避开，但晚期基因，编码结构或酶功能者(gag，env，pol)，其表达则有赖于反式作用性Rev蛋白质的存在，该Rev蛋白质为已知可透过与其关联RNA辨识部位Rev效应元件(Rev responsive-element)(RRE)(一种位于env开放读框内部的长度为351核苷酸(nt)之RNA茎-环结构(stem-loop structure))的交互作用而促进未剪接或部份剪接RNAs从细胞核输出到细胞质。虽则Rev/RRE作用即为充分地被接受为HIV-1晚期基因表达的必需先决条件，不过，在未剪接和单一剪接转录本内部所包含的不同顺式作用性元件对于Rev依赖性和时间调节性表达的关键性助成作用仍受到争议性地讨论着。因此，晚期单剪接或未剪接慢病毒mRNAs的Rev依赖性与时间调节性输出在大部份报告中都被解释为系经由无效剪接部份的形成所致或将其归因于座落在密码区内的抑制性序列(指的是INS元件)所致。虽则所谓的INS元件的正确本质和功能到目前尚未完全清楚，不过未剪接和单剪接慢病毒的mRNAs之Rev依赖性细胞核输出，至少在从异源启动子表达出之时，似乎会衔接到且需要有位于Gag密码序列的未翻译区5’(5’-UTR)内的主要剪接供体部位。此5’-UTR也含有部份的RNA包装信号(ψ)，其---不同于传统C-和D-型反转录病毒的ψ-部位----也会扩展到包括Gag和Pol读框的慢病毒基因组所含密码区内。虽然衍生自复杂反转录病毒如HTLV-1和2，慢病毒和泡沫病毒等的慢病毒载体颗粒，-病毒样颗粒和DNA或RNA构建体等可在基因治疗领域中提供大幅乐观性，不过DNA疫苗接种及/或疫苗接种仍存在着有关人类安全性的关切，原因在于HTLV和慢病毒例如HIV-1或HIV-2的惊人致病性潜在性之故。再者，由于在Gag和GagPol表达底下涉及的复杂病毒调节机制之故，有效率的表达不是受顺式作用元件(UTR，RRE)和反式作用性蛋白质(Rev，Tat)的存在所限制，就是对其严重地依赖着。Tat-不依赖性转录可以经由采用组成性哺乳动物启动子例如巨细胞病毒立即早期启动子/增强子单位而容易地达到。晚期HIV-1基因例如编码结构蛋白质或酶型蛋白质者，其Rev不依赖性表达系有高度需要者以期改良以慢病毒为基础的基因治疗所用载体颗粒和DNA疫苗之效率和安全性，以及用于哺乳动物表达系统中的抗原产生。通常，可以应用两种系统(a)Mason-Pfitzer猴病毒(MPMV)组成型转运元件(CTE)，一种座落于病毒基因组3’-未翻译区(UTR)内的顺式-作用性RNA元件，可以用来取代HIV-1Rev/RRE调节系统。此外，也发现了也能促进含内含子的RNAs的细胞核输出之来自多种病毒的数种其他顺式作用性RNA元件(例如，罗斯肉瘤病毒(Rous sarcoma virus)，猿猴反转录病毒第D型，禽白血病病毒，HBV)。因此，HPMV-CTE元件或功能性类似物顺式作用性RNA元件的添加可克服所谓的INS元件的作用，后者被认为是在没有Rev的存在时慢病毒RNAs受限于核的原因。(b)晚期HIV-1基因产物在Rev不存在中的低或无基因表达业经在所选密码子在编码DNA序列中的摆动位置(wobble position)之簇集单点突变而部份地克服(Schwartz et al.，1992a J.Virol.667176-7182；Schneider et al.，1997，J.Virol 714892-4903；Haas et al.，1996，Curr.Biol.6315-324)。此种作法的目的在于破坏所谓的INS元件以期促成所得Gag基因不依赖Rev的表达。不过，INS元件的存在，本质和功能仍受到争议性讨论，显示出根据单点突变将未充分鉴定的INS元件予以完全剔除(knockout)之目的仍然难以达到。这种观点已经由Qiu和同事们的观察予以肯定(Qiu et al.，1999 J.Virol.NOV；73(11)9145-52)，彼等证明将CTE元件添加到(只部份)变更的Gag基因后会导致Gag表达的进一步增加。此种现象不会发生于完全Rev-不依赖性Gag表达构建体。以HTLV-1和-2及慢病毒衍生的Gag和GagPol为基础的表达构建体之一种较佳应用为在高等真核生物表达系统如在哺乳动物细胞和昆虫细胞内的DNA疫苗接种及抗原、优选病毒样颗粒之产生。针对HIV-1 Gag和Pol产物的细胞介导的免疫反应业经证明具有对抗疾病的保护作用或至少有助于病毒复制的有效控制。因此，在有慢性感染的人体内，针对p24之HIV-1-特异性增殖反应以及Gag特异性CTL前体的数目都与所定出的病毒装载量有相反关联。再者，于CTL中针对Gag或Pol内所含高度保守性抗原决定部位的反应似乎关键地助成在长期非进展性HIV感染个体内对病毒复制的控制。在过去已经对于含有Gag和Pol的免疫原对免疫系统的呈现，拟出不同的格式，于彼等之中包括重组型病毒样颗粒(VLPs)及含Gag/Pol的DNA或RNA构建体。VLPs常在杆状病毒驱动的昆虫细胞表达系统中产生，其可用来旁通过在天然宿主或哺乳动物细胞中所看到的对Gag和Pol表达之复杂调节。此种VLPs在嚙齿动物及在非人灵长类中转变为高度免疫原性。不过，为了符合优良制造作业(Good Manufacturing Practice)(GMP)的规定及为了达到Gag/Pol多肽的正确翻译后修饰(包括必须包装在VLPs内或由VLPs呈现的共表达蛋白质)，使得GagPol和其衍生物在哺乳动物细胞系中的表达受到高度地重视。经由DNA直接注射的疫苗接种对于输送特异性抗原以进行免疫化为一种新颖且有希望的方法。质粒DNA免疫化比传统蛋白质疫苗接种具有潜在的优点，系因为前者可诱发出强T辅助(Thl)和CTL反应，长期抗原表达及长存的效应子(effector)活性因而可用于疫苗接种之故。于动物模型中，DNA疫苗接种业经证明会对于多种病毒性和寄生虫性病原诱导出保护性免疫性。于本文档来自技高网...

【技术保护点】
编码ｇａｇ和ｐｏｌ多肽的核酸序列，其中氨基酸Ａｌａ是由核酸三联体ｇｃｃ或ｇｃｔ所编码，Ａｒｇ是由ａｇｇ或ａｇａ所编码，Ａｓｎ是由ａａｃ或ａａｔ所编码，Ａｓｐ是由ｇａｃ或ｇａｔ所编码，Ｃｙｓ是由ｔｇｃ或ｔｇｔ所编码，Ｇｌｎ是由ｃａｇ或ｃａｔ所编码，Ｇｌｕ是由ｇａｇ或ｇａａ所编码，Ｇｌｙ是由ｇｇｃ或ｇｇａ所编码，Ｈｉｓ是由ｃａｃ或ｃａｔ所编码，Ｉｌｅ是由ａｔｃ或ａｔｔ所编码，Ｌｅｕ是由ｃｔｇ或ｃｔｃ所编码，Ｌｙｓ是由ａａｇ或ａａｔ所编码，Ｍｅｔ是由ａｔｇ所编码，Ｐｈｅ是由ｔｔｃ或ｔｔｔ所编码，Ｐｒｏ是由ｃｃｃ或ｃｃｔ所编码，Ｓｅｒ是由ａｇｃ或ｔｃｃ所编码，Ｔｈｒ是由ａｃｃ或ａｃａ所编码，Ｔｒｐ是由ｔｇｇ所编码，Ｔｙｒ是由ｔａｃ或ｔａｔ所编码，Ｖａｌ是由ｇｔｇ或ｇｔｃ所编码，且终止密码子为ｔｇａ或ｔａａ。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】...

【专利技术属性】
技术研发人员：拉尔夫瓦格纳，马库斯格拉夫，路德维希德姆尔，库尔特比勒尔，
申请(专利权)人：真那特有限公司，
类型：发明
国别省市：DE[德国]