丙型肝炎病毒高变区1合成肽及其应用制造技术

本发明专利技术涉及一种含有丙型肝炎病毒高变区１合成肽的多肽或其药物可接受的盐，其含有一个或多个如下所示的氨基酸序列的合成肽：ＧＱＴＹＴＳＧＸ，其中，Ｘ为Ａ或Ｇ。本发明专利技术还涉及上述多肽作为制备预防和／或治疗丙型肝炎的药剂的应用，以及含有上述多肽的治疗丙型肝炎的药物组合物、疫苗、编码该多肽的多核苷酸。（*该技术在2023年保护过期，可自由使用*）

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及分子生物学领域。尤其涉及一种含有丙型肝炎病毒高变区1合成肽的多肽或其药物可接受的盐，该多肽作为制备预防和/或治疗丙型肝炎的药剂的应用，以及含有该多肽的药物组合物、疫苗、编码该多肽的多核苷酸。丙型肝炎易慢性化的主要原因是由于丙型肝炎病毒极高的变异率，在免疫选择作用下，形成丙型肝炎病毒高变区1(HVR1区)基因的高度变异，以逃避免疫监视。报道表明，HVR1也是主要的中和抗原区段，含有重要的中和性抗原表位，能诱导宿主产生中和性抗体。因此阐明HVR1的中和抗原表位及这些抗原表位的变异规律，有助于保护性多肽及基因疫苗研制，是疫苗研究的关键。本专利技术人经过大量的研究，发现中国人HCV的变异并非完全随机，具有一定的保守性，各位点某种氨基酸的出现有特定的概率，且氨基酸的突变多是在具有相似理化性质的氨基酸之间，由此可见HCV的生存具有一定的生物学限制，既然高变区的变异具有一定的规律性的，本专利技术人提出了中国人II/III型HCV～HVR1区的保守位点是构成抗原的基本框架。另外有研究表明对不同HVR1序列诱生的抗HCV～HVR1的多肽之间有很强的交叉反应，也提示本区内有保守的抗原表位。目前，对于丙型肝炎病毒致病机制尚不清楚，还没有确实有效的治疗方法和疫苗以防止其进一步传播，现在临床上常使用的干扰素的长期有效率仅为20％，研究和发展降低HCV感染率，减轻病毒复制量的HCV疫苗是迫切需要完成的工作。对于HCV患者来说，研制针对丙型肝炎病毒的治疗药物更为有意义。优选本专利技术为如SEQ ID NO.1所述的合成肽GQTYTSGA或其药物可接受的盐；或如SEQ ID NO.2所述的合成肽GQTYTSGG或其药物可接受的盐。本专利技术还提供本专利技术的多肽在制备预防和/或治疗丙型肝炎的药剂的应用。本专利技术还提供一种用于预防和/或治疗丙型肝炎的药物组合物，其含有有效量的本专利技术的多肽和必要时药学上可接受的载体或赋形剂。本专利技术还提供一种疫苗组合物，其含有有效量的本专利技术所述的多肽和有效量的弗氏完全佐剂或弗氏不完全佐剂。本专利技术还提供一种编码含有本专利技术多肽的多核苷酸。本专利技术人在研究中国人群丙型肝炎病毒II/III型高变区1序列变异规律的基础上，通过计算机模建分析设计并合成了本专利技术的多肽，并对这些多肽进行了与HCV患者血清的反应性的研究，体外刺激HCV感染PBMC细胞因子分泌的研究，以及免疫小鼠体内免疫原性及血清中细胞因子研究。本专利技术提供的多肽或其药物可接受的盐，其含有一个或多个如下所示的氨基酸序列的合成肽GQTYTSGX，X为A或G。在本专利技术的实施方案中，本专利技术的多肽可以含有一个或多个如SEQ IDNO.1所示的氨基酸序列GQTYTSGA(肽A)或SEQ ID NO.2所示氨基酸序列GQTYTSGG(肽B)。在相邻的序列之间任选有适当的接头或没有接头。换句话说，本专利技术的多肽分子中如SEQ ID NO.1或SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列可以任选通过适当的接头相互连接，形成同聚或异聚的多聚体。本专利技术的多肽还可以与本专利技术人同一申请日提交的另一申请所公开的含有合成肽GQTYTSG的多肽连接，形成异聚的多聚体。另外，本专利技术多肽还可以与其它的蛋白形成融合蛋白，如可以与牛血清白蛋白形成融合蛋白，以增强其免疫原性。优选本专利技术多肽为如SEQ ID NO.1所述的合成肽GQTYTSGA(肽A)或如SEQ ID NO.2所述的合成肽GQTYTSGG(肽B)。根据计算机多肽HLA(人白细胞抗原)结合力分析及本专利技术的实施例2、3和4所示的结果，肽A和肽B表现出广泛的交叉反应性和强的诱导抗体产生的能力。这说明其中包含完整的抗原表位，另外，从本专利技术的实验数据也可以看出，肽A和肽B结构简单，生物活性好，是很好的活性肽分子，并具有优良的诱导内源性γ-IFN因子及Th2类细胞因子的功能。本专利技术的多肽可以单独使用，也可以以药物可接受的盐形式使用。“药物可接受的盐”指适于与人或动物的组织接触，而无过多的毒性、刺激、变态反应等的盐。药物可接受的盐是本领域熟知的。这种盐可以在本专利技术多肽的最终分离和纯化的过程中制备，也可以将多肽与适当的有机或无机酸或碱反应单独制备。代表性酸加成盐包括但不限于乙酸盐、二己酸盐、藻酸盐、柠檬酸盐、天冬氨酸盐、苯甲酸盐、苯磺酸盐、硫酸氢盐、丁酸盐、樟脑酸盐、樟脑磺酸盐、甘油磷酸盐、半硫酸盐、庚酸盐、己酸盐、富马酸盐、盐酸盐、氢溴酸盐、氢碘酸盐、2-羟基乙磺酸盐、乳酸盐、马来酸盐、甲磺酸盐、烟酸盐、2-萘磺酸盐、草酸盐、3-苯基丙酸盐、丙酸盐、琥珀酸盐、酒石酸盐、磷酸盐、谷氨酸盐、碳酸氢盐、对甲苯磺酸盐和十一烷酸盐。能用于形成药物可接受盐的优选的酸是盐酸、氢溴酸、硫酸、磷酸、草酸、马来酸、琥珀酸和柠檬酸。药物可接受的碱加成盐中的阳离子包括但不限于碱金属或碱土金属离子如锂、钠、钾、钙、镁和铝等，以及非毒性季铵阳离子如铵、四甲基铵、四乙基铵、甲基胺、二甲基胺、三甲基胺、三乙基胺、二乙基胺、乙基胺、二乙胺、乙醇胺、二乙醇胺、哌啶、哌嗪等。优选的碱加成盐包括磷酸盐、tris和乙酸盐。如实施例2、3和4所示，本专利技术的多肽或其药物可接受的盐具有诱导细胞因子γ-IFN、IL-4、IL-10和抗体产生的作用。由于γ-IFN主要是Th1分泌的细胞因子，是人体免疫系统抵抗病毒感染的主要细胞因子之一，而针对HCV的细胞免疫反应对于HCV的清除具有相当重要的意义。因此，本专利技术同时提供了一种具有预防和/或治疗丙型肝炎的作用的多肽。本专利技术的多肽可以按本领域技术人员已知的常规固相合成方法合成。例如本专利技术多肽肽可以按Steward and Young(Steward，J.M.and Young，J.D.，Solid Phase Peptide Synthesis，2ndEd.，Pierce Chemical Company，Rockford，I11.，(1984))描述的方法用Applied Biosystem合成仪或PioneerTM肽合成仪按固相化学技术合成。也可以先合成多个片段，然后连在一起形成更大的片段。对于固相肽合成，在Steward，J.M.and Young，J.D.，Solid Phase Peptide Synthesis，W.H.Freeman Co.(San Francisco)，1963和J.Meienhofer，Hormonal Proteins and Peptides，vol.2，p.46，Academic Press(New York)，1973中可以找到许多技术的介绍。一般，这些方法包括向成长的肽链上依次添加一个或多个氨基酸或适当保护的氨基酸。一般，第一个氨基酸的氨基或羧基用适当的保护基保护，然后将保护的氨基酸连在惰性固相载体上，随后在适于形成酰胺键的条件下加入相应氨基或羧基被适当保护的序列中的下一个氨基酸。然后从新加入的氨基酸残基上除去保护基，再加入必要时适当保护的下一个氨基酸，如此重复操作。当所有氨基酸以正确的顺序连接后，相继或同时除去任何剩余的保护基和固相支持物，得到最终的多肽。通过简单修改此一般程序，可能一次向成长链添加一个以上的氨基酸。制备本专利技术的较短的多肽，例如肽A或肽B优选的方法是固相肽合成，在本专利技术的一个优选实施方案中，本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种多肽或其药物可接受的盐，其含有一个或多个如下所示的氨基酸序列的合成肽： ＧＱＴＹＴＳＧＸ， 其中，Ｘ为Ａ或Ｇ。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：程云，李靖，舒翠丽，陈昊，赵军，王国志，郑宇，张英起，
申请(专利权)人：程云，中国人民解放军传染病研究所，
类型：发明
国别省市：11[中国|北京]