一种重组人血管内皮细胞生长因子的制备方法和应用技术

本发明专利技术属生物技术领域，具体涉及一种重组人血管内皮细胞生长因子１２１（ｒ－ｈＶＥＧＦ＃－［１２１］）及其制备方法和应用。本发明专利技术应用ＲＴ－ＰＣＲ方法，扩增人ＶＥＧＦ＃－［１２１］ｃＤＮＡ基因片段，与酵母表达载体ｐＰＩＣ９Ｋ重组，获得表达质粒ｐ９ＫＶＥＧＦ＃－［１２１］，转化毕赤酵母菌ＧＳ１１５，筛选出高效表达工程菌株。工程菌经发酵、诱导表达，分离纯化后，纯度９５％以上。实验证明本发明专利技术产物具有高效的促血管内皮细胞增殖功能和促血管通透作用和防治缺血性疾病的应用价值。（*该技术在2023年保护过期，可自由使用*）

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属生物
，涉及一种重组人血管内皮细胞生长因子121的制备方法和应用。人VEGF是由两条糖蛋白链形成的同源二聚体，由于基因转录水平剪切方式不同，VEGF至少有5种亚型，VEGF121、VEGF145、VEGF165、VEGF189和VEGF206，其中VEGF121和VEGF165功能最强且以可溶性蛋白形式分泌于细胞外，VEGF121没有亲肝素及硫酸乙酰肝素的特性，外源给予VEGF121更有利于其扩散，显示更强的活性(Neufeld G，et al.FASEBJ，1999，13(1)9-22，Mack C A，et al.J Thorac Cardiovasc Surg，1998，115(1)168-177)。VEGF是富含半胱氨酸生长因子超家族成员，其活性形式以二聚体形式存在，每个亚基有8个半胱氨酸参与形成二硫键，有一个糖基化位点。目前，国内外多采用下述三种表达系统表达hVEGF cDNA基因(1)大肠杆菌表达系统；(2)昆虫细胞表达系统；(3)哺乳类细胞表达系统。已有研究报道，大肠杆菌表达时复性困难，昆虫细胞和哺乳类细胞表达量低、纯化复杂、成本高。本专利技术用基因工程方法对r-hVEGF121进行生产，所得产品具有高效的促血管内皮细胞增殖功能和促血管通透作用，与已知的制备方法相比，不仅表达量高、成本低，并且制备工艺简便、安全。本专利技术还提供r-hVEGF121在治疗缺血性疾病的应用。本专利技术从HeLa细胞(购自美国ATCC，编号为CCL-2)中分离总RNA，并且用RT-PCR的方法克隆VEGF121cDNA基因。所述VEGF121cDNA基因序列如序列表SEQ ID NO1所示。获得的cDNA与质粒pUC19重组，DNA限制性内切酶酶切鉴定筛选阳性克隆，核苷酸序列分析验证cDNA基因。然后与表达载体重组，形成重组表达质粒。本专利技术不限于特定的表达质粒。在一优选实施方案中，本专利技术使用真核表达载体，例如pPIC9K等。上述重组表达载体按常规方法导入适宜宿主细胞。本专利技术不局限于任何特定的宿主细胞，只要它能够表达所述基因。在一优选实施方案中，本专利技术使用甲醇营养型毕赤酵母菌株如GS115等。本专利技术的表达产物分泌到胞外，存在于宿主细胞培养液上清内。离心去除宿主细胞，可从培养液上清分离和纯化所需产品。所述表达产物重组人血管内皮细胞生长因子121蛋白质氨基酸序列如序列表SEQ ID NO2所示。本专利技术上述技术方法中分子生物学操作均参照《分子克隆实验指南》(第二版，科学出版社，1992)。按照hVEGF121的氨基酸顺序，依照毕赤酵母偏好密码子设计引物序列。采用RT-PCR的方法扩增该基因并与pUC19重组，转化大肠杆菌JM109，提取质粒，以相应限制性内切酶酶解鉴定，获得特征性片断，证实获得阳性克隆。核苷酸序列分析证实基因序列正确。然后将VEGF121cDNA基因切出，并与毕赤酵母表达载体pPIC9K重组，构建真核表达质粒p9KVEGF121。转化大肠杆菌JM109，抽提质粒并做相应的限制性内切酶酶切分析，获得特征性片段，证实获得阳性克隆。本专利技术所采用限制性内切酶购自NEB公司，大肠杆菌JM109购自Promega公司，质粒pUC19购自Q-BIOgene公司，甲醇营养型毕赤酵母菌株GS115、毕赤酵母多拷贝表达载体pPIC9K购自Invitrogen公司(2)筛选高拷贝高效表达菌株酵母表达质粒p9KVEGF121用SalI线性化后，电穿孔法转化毕赤酵母GS115，使其与酵母染色体发生重组，G418筛选高效表达菌株。挑取上述阳性克隆，接种于甘油复合培养液BMGY中，其内含1％酵母提取物，2％蛋白胨，100mM磷酸缓冲液(pH6.0)，1.34％YNB，(4×10-5)％生物素和1％甘油，30℃培养至菌体光密度OD600nm达到2-6时，离心去除培养液，菌体沉淀，以甲醇复合培养液BMMY稀释至OD600nm为1，培养液BMMY含1％酵母提取物，2％蛋白胨，100mM磷酸缓冲液(pH6.0)，1.34％YNB，(4×10-5)％生物素和0.5％甲醇。诱导培养7d，每12小时取样并补加甲醇维持其浓度0.5％，30℃诱导表达，保留培养液上清，作15％SDS-PAGE非还原电泳，考马斯亮蓝R-250染色后，Pharcia ImageMasterVDS扫描定纯度、分子量。结果显示诱导后上清液在相应分子量处有浓集的条带。经扫描，目的蛋白约占菌体总蛋白的40％左右。以表达水平高的克隆为工程菌株。上述非还原性SDS-PAGE按Laemmli方法进行(参照《分子克隆实验指南》)。(3)工程菌高密度发酵表达取上述高表达菌株作为工程菌，用Bio FLU3000 5L发酵罐(NBS公司)进行高密度发酵。将解冻的种子菌划YPD平板，30℃温箱培养。挑取单菌落，分级接种于BMGY培养液中，将OD600nm达到2-6的种子菌接入发酵罐后，自然增殖，根据甘油被耗尽情况，补充基础培养基甘油溶液，补充速度是16ml/L/h，OD600nm达到120左右止。所述基础培养基所含成分是85％H3PO4，CaSO4·2H2O，K2SO4，MgSO4·7H2O，KOH和含微量元素的甘油溶液，所述甘油溶液含微量元素CuSO4·5H2O，MnSO4·H2O，H3BO3，ZnCl2，KI，Na2MoO4·2H2O，CoCl2，FeSO4·7H2O，浓硫酸，CaSO4·2H2O和Biotin。培养基中甘油耗尽后，用甲醇溶液进行诱导表达并根据耗尽情况补料，所述甲醇溶液含微量元素CuSO4·5H2O，MnSO4·H2O，H3BO3，ZnCl2，KI，Na2MoO4·2H2O，CoCl2，FeSO4·7H2O，浓硫酸，CaSO4·2H2O和Biotin。甲醇补料速度从1ml/L/h逐渐升高至12ml/L/h，维持此速度。本专利技术发酵参数为温度30℃，氧容量控制在35±5％，pH＝5，搅拌速度与氧容量连动。高密度发酵诱导表达结果表明VEGF121cDNA获得了高表达。甲醇诱导30h后，停止发酵，放出罐中菌液离心，分离沉淀菌体，收集上清进行纯化。经测试，发酵工程菌的表达水平为70％。(4)超滤浓缩脱盐将离心所得上清经Millipore超滤装置(NMWL10000，Millipore公司)浓缩至0.5L，脱去无机盐。(5)凝胶过滤Sephadex G-50(Pharmacia公司)柱用20mmol/L PB(pH7.4)平衡后，将超滤浓缩液上样，用PB洗脱，收集活性蛋白峰。(6)Q-Sepharose Fast Flow柱层析Q-Sepharose F.F.(Pharmacia公司)柱以10倍体积的50mmol/LPB(pH7.4)平衡，凝胶过滤后收集活性蛋白峰直接上柱后，用50mmol/L PB(pH7.4)继续洗脱至基线，用0-1mol/L NaCl(50mmol/LPB，pH7.4)线性梯度洗脱，收集活性组分，进行纯度分析。本专利技术所述色谱操作均为常规操作。(7)纯度鉴定及分子量测定取纯化样品进行15％SDS-PAGE非还原电泳，考马斯亮蓝R-250染色后，Pharmacia InageMasterVDS扫描测定纯度，所得产品纯度95％以上，分子量约本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种制备重组人血管内皮细胞生长因子１２１的方法，其特征在于采用下列步骤：（１）分离总ＲＮＡ，用ＲＴ－ＰＣＲ的方法克隆ＶＥＧＦ↓［１２１］ ｃＤＮＡ基因；（２）ＶＥＧＦ↓［１２１］ ｃＤＮＡ基因与表达载体重组；（３）用上述重组表达 载体电穿孔法转化宿主细胞，使ＶＥＧＦ↓［１２１］ ｃＤＮＡ基因以多拷贝形式与宿主细胞染色体发生重组；（４）培养宿主细胞，从培液中回收和纯化终产物；（５）生物学方法鉴定重组人血管内皮细胞生长因子１２１。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：宋后燕，王跃祥，
申请(专利权)人：复旦大学，
类型：发明
国别省市：31[中国|上海]