一种流感病毒基因工程表位疫苗及其制备方法技术

本发明专利技术的名称为一种流感病毒基因工程表位疫苗及其制备方法。本发明专利技术的目的是提供一种能够有效抗御流感病毒变异的基因工程表位疫苗。本发明专利技术的流感病毒基因工程表位疫苗，它基本上是包括由下列成员中的一个或多个连接而成的肽段：１）至少一个流感病毒的中和表位及其变异表位；２）至少一个流感病毒的Ｔ细胞表位；３）至少一个流感病毒的ＣＴＬ细胞表位。制备流感病毒基因工程表位疫苗的方法，是利用聚合酶链式反应和限制性核酸内切酶将编码至少一个流感病毒的中和表位及其变异表位或／和至少一个流感病毒的Ｔ细胞表位或／和至少一个流感病毒的ＣＴＬ细胞表位的ＤＮＡ序列重复串联或组合重复后串联，成为一个人工基因，并将该基因在表达载体系统中表达后纯化，得到流感病毒基因工程表位疫苗。本发明专利技术的疫苗将对预防医学研究产生重大影响，并且将带来巨大的经济效益和社会效益。（*该技术在2022年保护过期，可自由使用*）

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及一种流感疫苗，特别是用生物工程的方法得到的流感疫苗。2.目前国外儿童正在使用的是流感病毒亚单位疫苗。该疫苗是利用基因重组的病毒表面抗原诱导免疫保护，也需要随流感毒株抗原性变异及时改变基因重组的病毒表面抗原。流感的最主要特性之一是流感病毒亚型的多样性和病毒抗原的高变异性，所以使得上述正在使用的流感疫苗不能有效预防不同流感病毒亚型或不同变异株引发的流感的发生和流行。在流感的免疫预防中，病毒编码蛋白上的中和表位(如KAYSNCYPYDVPDY；ATGLRNIPSIQSRGLFGAIAGFIEG；GLFGAIAGFIEG；WTGVAQD；HHPITDSDQTRLY等；)能诱导很强的对付相对应的病毒株的免疫防护。(PNAS 1992，898995-8999；PNAS 1982，79569-573；Vaccine 1995，13927-932；Eur.J.Immunol.1997，273105-3114；Nature Medicine 1999，51157-1163)。本专利技术的专利技术人于1999年在世界上首次提出了用表位疫苗对付病毒及其病毒变异的观点(Immunology Today 1999，20588-589；Immunology Letters 773-6)。表位疫苗可含有多个病毒亚类的多个抗原表位(包括中和表位和CTL表位)，从而能够诱导多个表位特异性的抗体应答和CTL应答，显示出较强的抗病毒变异的能力。本专利技术的专利技术人在研究艾滋病表位疫苗时发现多表位的表位多肽能够诱导高滴度的、预先定义的、多中和表位特异性的中和抗体，该理论对研究制造流感疫苗具有指导意义。此外，本专利技术的专利技术人在研究流感合成肽表位疫苗时发现流感合成肽表位疫苗诱导的高滴度的预先定义的中和表位特异性的抗体能够抑制流感病毒感染靶细胞(Int.Arch.Allergy Immunology，论文正在印刷)。因此表位疫苗可能成为疫苗研究的一个重要发展方向，有可能成为对付病原体变异的关键手段。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种能够有效抗御流感病毒变异的基因工程表位疫苗。流感病毒基因工程表位疫苗，它基本上是包括由下列成员中的一个或多个连接而成的肽段1) 至少一个流感病毒的中和表位及其变异表位；2) 至少一个流感病毒的T细胞表位；3) 至少一个流感病毒的CTL细胞表位。所述中和表位和变异表位可以是下列成员之一ATGLRNIPSIQSRGLFGAIAGFIEGWTGVAQDHHPITDSDQTRLYKAYSNCYPYDVPDYKNEWGCRCNDSSDKETPIRNEWGSLLTEVETVETPIRNERNEWGCRCEWGCRCNDGWTGVAQDGITDSDQTRGSTDKEQTDGSTDREQTKGKAYSNCYGKAFSNCYG所述T细胞表位可以是下列成员之一TYQRTRALVRTGRLIQNSLTIERMVLS所述CTL细胞表位可以是下列成员之一TMVMELIRMIKTMVMELVRMIK为了适于注射所述疫苗中还包括医学上可接受的药用佐剂，如铝佐剂等。本专利技术的另一个目的是提供编码上述流感病毒基因工程表位疫苗的DNA序列。由于基因的简并性，编码相同肽段的DNA序列不是唯一的，但均应属本专利技术的保护范围。本专利技术的又一目的是提供制备流感病毒基因工程表位疫苗的方法。制备流感病毒基因工程表位疫苗的方法，是利用聚合酶链式反应和限制性核酸内切酶将编码至少一个流感病毒的中和表位及其变异表位或/和至少一个流感病毒的T细胞表位或/和至少一个流感病毒的CTL细胞表位的DNA序列重复串联或组合重复后串联，成为一个人工基因，并将该基因在表达载体系统中表达后纯化，得到流感病毒基因工程表位疫苗。欲串联在一起的包括至少一个流感病毒的中和表位及其变异表位或/和至少一个流感病毒的T细胞表位或/和至少一个流感病毒的CTL细胞表位的寡核苷酸片段的两端包含一对能够产生匹配末端的内切酶。为了便于操作，对所选表位给予标记，在表位序列后，导入一标签DNA片段。本专利技术在设计上巧妙地将多个流感病毒亚型的多个中和表位、T细胞表位和CTL细胞表位组合在一起，形成了能够刺激人体对流感病毒产生多种中和抗体和细胞免疫应答的基因工程表位疫苗，极大地提高了疫苗抗病毒变异的能力。本专利技术的疫苗具有以下优点1、该疫苗含有流感病毒不同亚型的多种表位，能刺激产生细胞免疫和体液免疫，有效对付病毒的变异，进而克服已有常规灭活疫苗或减毒疫苗预防效果差甚至无效的缺点；2、该疫苗中的表位多肽，没有流感病毒的遗传物质，不会产生因遗传物质诱发的副作用，也没有流感灭活疫苗或减毒疫苗可能的危险。3、在流感病毒变异后，能够迅速地进行相应表位的调整，不需进行长时间的试验，降低成本。该技术将对预防医学研究产生重大影响，并且将带来巨大的经济效益和社会效益。下面结合具体实施例对本专利技术作进一步说明。5’gga tcctgg acc gga gtg gcg cag gac ggc tgg acc gga gtg gcg cag gac ggctgg acc gga gtg gcg cag gacaga tcttgagct cga gtcg 3’Primer 15’gc gga tcc tgg acc gga 3’Primer 25’aga tct tga gct cga g tcg 3’2、通过PCR扩增上述寡核苷酸链，得到相对应的、分别含有酶切位点的双链寡核苷酸链。将PCR产物分别克隆到T载体中，并在其后连入一个标签片段，得到相对应的重组克隆。3、利用BamHI/BgII内切酶酶切得到阳性克隆，回收带有标签的表位DNA片段和没有标签DNA的载体片段。利用末端匹配的性质，将表位片段重复连接，获得免疫原基因。4、将得到的免疫原基因插入表达载体大肠杆菌JM109中进行表达，得到流感病毒重组表位疫苗的免疫原。5、将纯化的免疫原与福氏佐剂混合制备成单表位重复的流感病毒基因工程表位疫苗。实施例2、制备多表位重复的流感病毒基因工程表位疫苗1、人工合成与WTGVAQD，KAYSNCYPYDVPDYGK和HHPITDSQTRLY相对应的、包含一对匹配末端的BamHI/BgII内切酶位点的重复核苷酸序列，同时合成相应的引物。A5’gga tcctgg acc gga gtg gcg cag gac ggc tgg acc gga gtg gcg cag gacggc tgg acc gga gtg gcg cag gacaga tcttgagct cga gtcg 3’Primer 15’ gc gga tcc tgg acc gga 3’B5’gga tcc aaa gct tac agc aac tgt tac cct tat gat gtg ccg gat tat ggcaaa gct tac agc aac tgt tac cct tat gat gtg ccg gat tataga tcttga gct cgag tcg 3’Primer 25’gt gga tcc aaa gct tac 3’C5’gga ttc cac cac ccg agt acg gac agt gac caa acc agc ata tat ggc cac本文档来自技高网...

【技术保护点】
流感病毒基因工程表位疫苗，它基本上是包括由下列成员中的一个或多个连接而成的肽段：４） 至少一个流感病毒的中和表位及其变异表位；５） 至少一个流感病毒的Ｔ细胞表位；６） 至少一个流感病毒的ＣＴＬ细胞表位。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：陈应华，李华，刘祖强，陆韵，丁健，刘万里，
申请(专利权)人：清华大学，
类型：发明
国别省市：11[中国|北京]