本发明专利技术提供一种从苜蓿根瘤菌ＲｈｉｚｏｂｉｕｍｍｅｌｉｌｏｔｉＩＭＡＳＡＳ１．１６６Ｍ０１０中克隆到的草甘膦抗性基因（Ｇｌｒ）以及含有该基因的载体和转化子。该基因的序列总长为１０５９ｂｐ。含有Ｇｌｒ序列的农杆菌穿梭质粒ｐＣＡＭＢＩＡＧｌｒ，在烟草中表达使植物对草甘膦具有抗性。该基因不仅能转化制造草甘膦抗性植物，也可作为筛选转基因植物品系的标记基因。（*该技术在2023年保护过期，可自由使用*）
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及一种草甘膦抗性基因以及含有该基因的载体和转化子。
技术介绍
化学除草已成为现代化农业生产的重要组成部分。全世界除草剂的总用量、施用面积及费用均已超过杀虫剂和杀菌剂的总和。在众多的除草剂中，草甘膦(N-phosphonomethylglycine)是目前世界上使用最为广泛的一种。它的优点是对人畜无毒，降解快，对环境污染非常小，而且价钱便宜，因而深受欢迎。仅美国每年销售量就达几百万美元。草甘膦是一种广谱、内吸性的除草剂，它可无选择地抑制所有植物的5-烯醇式丙酮酰莽草酸-3-磷酸合酶(下面简称EPSPS)活性，阻断植物芳香族氨基酸的合成，因此它也抑制农作物的生长。应用基因工程技术培育对草甘膦具有抗性的农作物，对于安全使用草甘膦具有重要意义。目前，获得抗草甘膦转基因农作物研究途径主要有一、导入过量表达的EPSP合酶基因，以此抵御草甘膦的竞争性抑制；二、导入通过定点突变而获得对草甘膦低亲和性或无亲和性的EPSP合酶，从而减轻草甘膦的抑制作用。但通过以上两个途径获得的转基因农作物对草甘膦的实际抗性却并不理想。已有报道草甘膦对莽草酸的生物合成、核酸的生物合成以及光合磷酸化及ATP酶的活性都有抑制。所以植物代谢中可能存在着草甘膦作用的多个靶位点。概括来说EPSPS转基因农作物对草甘膦的作用机理上是起一种拮抗作用，并没改变除草剂的代谢。如果能够到找与草甘膦代谢相关的基因，利用这样的基因获得具有高效降解底物能力的转基因农作物。通过加快分解草甘膦解除它对作物的毒害，才能从根本上提高植物对除草剂的抗性，对环境保护也有着重要意义。甲基磷酸、乙基磷酸和草甘膦等有机膦化合物中的磷元素，都是以相同的C-P单键形式存在，具有微生物能裂解该键。Zeleznicketal在1963年首次发现，E.coli能裂解C-P键利用甲基磷酸或乙基磷酸作为磷源。却并不能利用草甘膦。而有些土壤细菌例如根瘤菌(Flavobacterium spp.)菌株及农杆菌(Agrobacterium spp.)等不仅与E.coli相同能利用甲基磷酸和乙基磷酸，而且能裂解草甘膦的C-P键，产生肌氨酸和无机磷，作为细菌的磷源加以吸收。这两种的代谢差异体现在分子水平上就是该代谢途径相关基因的差异。可是Parker在1999年的实验证明在能降解草甘膦的Rhiz.mcliloti中有与E.coli的C-P降解酶体系基因同源的基因簇。这就提示了两种的C-P键裂解谢途径的差异，并不没改变降解酶的特性。那些能利用草甘膦作为磷源的土壤细菌也许是在C-P键裂解谢途径存在某个基因让细菌获得了草甘膦抗性，而使它们的C-P降解酶能正常工作降解草甘膦。迄今除了EPSP合酶突变基因外，其它与草甘膦相关基因转化植物的研究尚未深入。除草剂抗性基因替代抗生素抗性基因，也是迫切开发这类基因的意义。我们实验室在草甘膦相关基因方面作了很多探索。对不同种属的微生物利用草甘膦的能力通过数种方式作了量化比较，筛选出具有高效降解能力的菌株进行以下研究。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种新的草甘膦抗性基因及含该基因的功能表达载体和转化子。本专利技术是根据基因互补的原理，利用现代分子生物学和DNA重组技术，选择具有降解草甘膦能力的微生物，从中分离和克隆草甘膦抗性基因。专利技术人在研究中发现苜蓿根瘤菌Rhizobium meliloti(中科院微生物研究所保藏编号IMAS AS1.166M010)具有高效降解草甘膦的能力，提示其含有草甘膦抗性基因。本专利技术以苜蓿根瘤菌Rhizobium meliloti IMAS AS1.166M010菌株为材料建立基因文库，然后转化到不能降解草甘膦的大肠杆菌中去，通过基因互补获得草甘膦抗性基因。通过基因测序获得1059bp的DNA编码序列，命名为Glr基因。我们构建了含有Glr基因的细菌质粒转化大肠杆菌，检测比较它和对照在不同草甘膦浓度的无磷培养基中的生长情况。由此证明Glr基因的存在提高了宿主对草甘膦的抗性。为了确证我们所获得的新基因的实用性，将其连接到植物转化载体转入模式植物烟草中进行表达，叶片抗性实验和整株幼苗的草甘膦筛选实验都证明我们克隆到的Glr基因有提高生物对除草剂草甘膦的抗性作用。本专利技术所用的苜蓿根瘤菌来源于广东省微生物研究所菌种保藏选育实验室。本专利技术的草甘膦抗性基因Glr的DNA序列如序列表所示。本专利技术的草甘膦抗性基因Glr可以按照序列表中<400>1所示的序列通过已知的常规方法合成得到。本专利技术的pCR Glr质粒是在pCR2.1质粒载体上位于BamHI和XhoI酶切位点间插入上述的草甘膦抗性基因Glr片段而得到。其结构如图2所示。本专利技术的pCAMBIA Glr质粒是在pCAMBIA 1300质粒载体上位于T-DNA区域的BamHI-XbaI位点间，从5′到3′方向插入了含有CaMV35S启动子序列烟草TSPGlr.Nos终止子序列的片段而得到；Glr为上述的草甘膦抗性基因Glr。该质粒的结构如图4-2所示。本专利技术的LBA Glr的工程菌是它由上述的质粒pCAMBIA Glr转化农杆菌LBA4404而获得。以下通过附图和实施例对本专利技术作进一步说明。附图说明图1是野生型苜蓿根瘤菌Rhizobium meliloti IMAS AS1.166M010在含有不同浓度草甘膦的无磷液体培养基中的生长曲线；图2是含有草甘膦抗性基因的质粒pCRGlr结构图；图3是XLI-pCRGlr转化子、以及对照XLI-pCR2.1转化子在含有不同浓度草甘膦的无磷液体培养基中的生长曲线；图4-1是TSP，Glr和Nos polyA片段克隆到pCR2.1载体构建示意图；图4-2是CaMV35S，与TSPGlrNos PolyA大片段克隆到表达载体pCAMBIA1300的构建示意图；图5是诱导生根的抗性幼苗照片；图6是再生植株的PCR分析电泳结果照片；图7是叶片盘法草甘膦抗性分析结果照片；图8是整体植株草甘膦抗性分析照片。具体实施例方式实施例1.检测苜蓿根瘤菌降解草甘膦能力将苜蓿根瘤菌Rhizobium meliloti IMAS AS1.166M010接种在含有0，2，4，6，8和10mM草甘膦的液体根瘤菌无磷培养基(培养基成分见表1)中，测定其生长曲线(见图1)。从曲线上可见，在含2.0mM草甘膦的液体无磷培养基中，该菌的生长速度最快；但是随着草甘膦浓度的提高，其生长也逐渐受到抑制。说明苜蓿根瘤菌具有较强的降解草甘膦的能力。表1.液体根瘤菌无磷培养基成分MOPS/KOH(pH7.4) 25mM， MgSO42mM，柠檬酸铁 100μM，CaCl21.2mM，NH4Cl33mM， 维生素B10.5mg/L，烟酸 0.1mg/l， 生物素 0.1mg/L泛酸，0.5mg/L 丁二酸钠50mM微量元素CoCl20.8μM，CuSO440μM，H3BO414μM， MnCl20.1μM，Na2MoO410μM， ZnSO41.5μM。实施例2.建立苜蓿根瘤菌基因文库将苜蓿根瘤菌Rhizobium meliloti IMAS AS1.166 M010的单菌落接种于200ml根瘤菌丰富培养基(培养基成分见表2)中，在28℃空气浴中震荡培养48小本文档来自技高网...
【技术保护点】
命名为Ｇｌｒ的草甘膦抗性基因的ＤＮＡ序列，其特征是该ＤＮＡ序列的总长为１０５９ｂｐ，具体序列如序列表所示。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：李绿砚，步怀宇，徐培林，
申请(专利权)人：中山大学，
类型：发明
国别省市：81[中国|广州]
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