抗表皮生长因子受体的人源化抗体制造技术

本发明专利技术提供一种人源化形式的抗体３４０，它可由保藏于ＥＣＡＣＣ、保藏号为９７０２１４２８的细胞系获得。发现该抗体杀死细胞的能力高于鼠抗体３４０。也提供编码该抗体的核酸，以及该抗体在药物上、特别是在癌症治疗中的应用。（*该技术在2021年保护过期，可自由使用*）

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及人源化抗体及其片段，特别是，表皮生长因子受体(EGFR)特异的人源化抗体。
技术介绍
EGFR是一种肿瘤相关细胞表面抗原，是众所周知的抗体的靶标。Durrant等人(Prenatal Diagnosis，14，131-140，1994)描述了一种小鼠单克隆抗体，称为“340”，它可与EGFR高特异性地结合。表达该抗体的细胞系保藏于ECACC，保藏号为97021428。单克隆抗体340针对骨肉瘤细胞系791T。免疫沉淀研究表明，340识别来自骨肉瘤肿瘤和胎盘组织的一种分子量为170kDa的膜糖蛋白。对纯化抗原的末端氨基酸测序显示与表皮生长因子受体有序列同一性。为了证实340抗原是EGF受体，放射性标记的EGF和EGF受体抗体显示与S340抗体抗原结合。而且，340能与EGF竞争结合其受体，EGF能与340竞争结合其抗原。大量研究表明，340能与结肠直肠、胃、卵巢、骨肉瘤肿瘤细胞系结合。该抗体也能识别胚胎滋养层，并且已经用于从母体血液中分选胎细胞。其它几种小鼠单克隆抗体显示可识别EGF受体。它们大致分为两类可与受体结合但不抑制EGF结合的抗体，可与受体结合并且抑制EGF结合的抗体。340单克隆抗体属于后者。发现患者对啮齿动物抗体产生的免疫应答限制了啮齿动物(特别是小鼠)单克隆抗体在人类治疗和体内诊断中的应用。患者产生所谓的“HAMA”(人抗小鼠抗体)反应限制了抗体到达其抗原靶标的能力，使抗体的效能降低。为了减少HAMA反应，研制了嵌合抗体，其中小鼠可变(V)区与人恒定(C)区连接。该抗体证明在临床上有用，但是小鼠V区成分仍为患者中产生免疫原性提供了基础(LoBuglio等人，Proc.Nat.Acad.Sci.USA，86，4220-4224，1989)。因此发展了人源化抗体技术，用于将啮齿动物抗体的互补决定区(CDRs)移植到人V区上并与人C区连接，产生“非人类”成分只是与人构架区相邻的CDR的抗体。然而，不久即认识到，简单移植CDR通常导致人源化抗体亲和力降低，因此为了恢复亲和力需要在人V区构架中引入某些非人类氨基酸。生产人源化抗体的这些方法的共同方面是生产在人体中基本没有免疫原性的抗体。然而，实现手段是向啮齿动物抗体中引入尽可能多的人类序列。众所周知，某些短肽序列或“表位”在人体中可能有免疫原性。因此发展了通过计算机分析鉴定这些表位并置换氨基酸产生非免疫原性肽的技术(WO98/52976和WO00/34317)。专利技术者已经生产了免疫原性降低的人源化340抗体(称为“340Ch”(对于小鼠人嵌合体)或“SC100”(对于去免疫的(deimmunised)抗体))，目的在于提供临床上有用的治疗工具。他们意外地发现这些人源化抗体与原始鼠抗体类似地结合表达EGFR的细胞，但抑制这些细胞生长的能力增强。
技术实现思路
因此，根据本专利技术的第一方面，提供了一种人源化形式的抗体340，它可由保藏于ECACC、保藏号为97021428的细胞系获得。优选地，本专利技术的抗体含有人类抗体构架中提供的抗体340的CDRH3。该抗体还可含有340重链或轻链的一个或多个其它CDR。附图中的图2显示了这些CDR。它可含有抗体340的超变区。超变区之外的可变区可以来自于人类抗体的可变区。制备这些抗体的方法在本领域周知，例如Winter，美国专利号5,225,539。抗体超变区之外的可变区也可来自于单克隆抗体340。制备这些抗体的方法在本领域周知，包括，例如Boss(Celltech)的美国专利号4,816,397和Cabilly(Genentech)的4,816,567所述。因此，在一个优选实施方案中，该抗体含有人类抗体构架和抗体340可变区的基本部分，优选地如图2所示的可变区。在另一个实施方案中，该抗体含有人类抗体构架和如图6所示的VHb、c、d或e之一，和如图7所示的VKb、c或d之一。优选的抗体含有人类抗体构架与VHd和VKd或VHd或VKb。人类抗体构架优选地是人类抗体恒定区的全部或一部分。例如，图2所示的基于VL区全部或一部分的人源化抗体可以在其C端与抗体轻链恒定域(包括人Cκ或Cλ链)连接。类似地，图2所示的基于VH区全部或一部分的抗体可以在其C端与来自任何抗体同种型(例如IgG、IgA、IgE和IgM)和任何同种型亚型(特别是IgG1和IgG4)的免疫球蛋白重链的全部或一部分连接，优选IgG1。单克隆抗体通过在配体受体的配体结合部位附近结合，并在空间上阻断向配体接近，从而阻断配体。此外，抗体也可分子模拟配体并在配体结合部位处相互作用。专利技术者在此表示，340抗体及其SC100衍生物是独特的，因为它们不仅在配体结合部位结合，而且显示与通过二级结构聚集的配体之两个不同区域有氨基酸同源性。而且，CDRH3区的重要性在细胞结合研究中得到证实，当改变该区内的一个氨基酸时，SC100与EGFr的结合大大降低。这意味着，含有与肽配体显示同源性的CDR区的抗体能与配体有效地竞争结合受体。因此能阻断与配体/受体相互作用有关的胞内信号传导。在该实施例中，由于EGF既是生长因子又是存活因子，用其受体阻断其相互作用导致细胞生长抑制和凋亡。由于EGF受体在恶性肿瘤中普遍过量表达，用药物或抗体阻断EGF受体能抑制肿瘤生长。这些试剂显示在联合化学治疗中特别有效，能导致动物模型的肿瘤消退。由于抗体能以多种方式修饰，术语“抗体”应视为包括含有具有所需特异性的结合域的所有特异性结合成员或物质。因此，该术语包括抗体片段、衍生物、抗体的功能相当物和同源物，包括含有免疫球蛋白结合域的任何多肽。完整抗体的片段能行使结合抗原的功能。结合片段的例子有(i)由VL、VH、CL和CH1域组成的Fab片段；(ii)由VH和CH1域组成的Fd片段；(iii)由单一抗体的VL和VH域组成的Fv片段；(iv)由VH域组成的dAb片段(Ward，E.S.等人，Nature 341544-546(1989))；(v)分离的CDR区；(vi)F(ab’)2片段，即含有两条连接的Fab片段的双价片段；(vii)单链Fv分子(scFv)，其中VH域和VL域通过一个允许两个域结合的肽接头连接，形成抗原结合部位(Bird等人，Science242423-426(1988)；Huston等人，PNAS USA 855879-5883(1988)；(viii)双特异性单链Fv二聚体(PCT/US92/09965)；(ix)“叠抗(diabodies)”，即通过基因融合构建的多价或多特异性片段(WO94/13804；P.Hollinger等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA906444-6448(1993))。叠抗是多肽的多聚体，其中每条多肽含有含免疫球蛋白轻链结合区的第一个域和含免疫球蛋白重链结合区的第二个域，这两个域连接(例如通过肽接头)在一起，但不能彼此结合形成抗原结合部位，抗原结合部位由多聚体内一条多肽的第一个域与多聚体内另一条多肽的第二个域结合形成(WO94/13804)。在使用双特异性抗体时，可以是常规的双特异性抗体，它们能用多种方法生产(Hollinger和Winter，Current Opinion Biotechnol.19934446-449)本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种人源化形式的抗体３４０，其可由保藏于ＥＣＡＣＣ、保藏号为９７０２１４２８的细胞系获得。

【技术特征摘要】
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【专利技术属性】
技术研发人员：JRM艾里斯，LG杜兰特，
申请(专利权)人：梨树化学株式会社，
类型：发明
国别省市：KR[韩国]