本发明专利技术公开了一种人端粒酶反转录酶样组分的基因突变体的新用途，即其在制备治疗肝癌的药物中的应用。该基因突变体的基因顺序包括在端粒酶反转录酶样组分各保守结构域的各种可能的突变顺序，该基因突变体的载体为真核表达质粒或核酸病毒，其作为药物的给药方式为静脉注射或肌肉注射。（*该技术在2022年保护过期，可自由使用*）
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及一种人端粒酶反转录酶样组分的基因突变体的新用途，特别涉及其在制备治疗肝癌的药物中的应用。
技术介绍
端粒(telomere)是存在于真核生物线性染色体末端的由串联重复的DNA序列及其相关蛋白所组成的结构，由于能防止染色体的端-端融合、重组和降解，故具有稳定染色体的作用。如所周知，参与真核生物线性DNA复制的DNA聚合酶并不能使染色体DNA完全复制，因而染色体末端的端粒序列在不断分裂的过程中逐渐缩短。当人染色体的末端，又称末端限制片断TRF(terminal restriction fragments)，缩短到5-7Kbp时，细胞就会发生衰老(Harley CB et al.Cancer Surveys 1997 29263-84)，因此，端粒的长度和细胞寿命的控制相关。 端粒酶是一种由蛋白质和RNA构成的核糖核蛋白体。在绝大多数的真核生物中，端粒的长度都是通过端粒酶(telomerase)维持的。正常体细胞中，除生殖细胞、骨髓造血干细胞及外周淋巴细胞等少数细胞外，一般没有端粒酶的活性，染色体末端的端粒序列便会不断缩短。由于肿瘤细胞是永生性的细胞，不会衰老，而85％的肿瘤细胞都具有端粒酶的表达(Shay JW et al.Eur J Cancer 1997 33787-91)，因此，端粒酶的活性与表达程度和肿瘤的发生、恶性及转归间的关系便成为近年来生物学和基础医学共同关注的热点。端粒酶的激活可能是肿瘤发生的早期事件(Cheng RYS et al.Br J Cancer1998 77456-60)。 端粒酶的有关蛋白组分中，有一部分被称之为端粒酶反转录酶样结构(hTERT)的组分，目前引起了学界的关注，hTERT的编码基因具有七个反转录酶保守结构域和一个端粒酶特异的保守结构域，其表达调控是多水平的，涉及转录、转录后mRNA剪切和蛋白磷酸化等，其中主要的调控方式是转录水平调控(Liu JP.FASEB J 1999 132091-104)。对hTERT基因启动子区的分析表明，其启动区存在转录因子MYC和Sp1的结合位点，核心调控区由59bp组成，位于-280到-150(Horikawa I，et al.Cancer Res 199959826-30、Kyo S，et al.Nucleic Acids Res 2000 28669-77)。 人类端粒酶催化亚单位或端粒酶反转录酶样组分(hTERT，humantelomerase reverse transcriptase subunit)是人类端粒酶的重要组分，有活性的端粒酶反转录酶样组分可以说是绝大部分恶性肿瘤共同的“标志蛋白”，这种蛋白只在恶性肿瘤细胞中表达，在正常细胞中则没有表达，其表达水平与肿瘤细胞的端粒酶活性水平呈正相关。如果研制成一种人类端粒酶催化亚单位或端粒酶反转录酶样组分的基因突变体，就有可能通过竞争抑制去抑制端粒酶的活性，阻断肿瘤细胞的有丝分裂，从而达到控制肿瘤生长的目的。 考虑到hTERT蛋白相对于肿瘤细胞的特异性，启发我们打算用hTERT基因的点突变体(DN-hTERT)去抑制人肝癌细胞的异常分裂，从而有可能将这种点突变的基因通过载体注入患者体内进行基因治疗，达到控制肝癌的目的。根据文献报道，应用PCR定点突变的方法，将端粒酶反转录酶样组分的第三个保守的反转录结构域中710和711位的编码天冬氨酸和缬氨酸残基的序列替换为编码丙氨酸和异亮氨酸的序列，从而构建了端粒酶反转录酶组分的功能域突变体(dominant negative form of hTERT，DN-hTERT)，其基因序列见序列表中的<210>1(Counter CM，et al.Proc Natl Acad Sci USA 19989514723-8、Hahn WC，et al.Nat Med 1999 51164-70)，已有文献报道该功能域突变体在卵巢癌细胞(36M)、乳腺癌细胞(SW613和SKBR3)和结肠癌细胞LoVo中可以有效抑制上述各种癌细胞的端粒酶活性进而使之发生凋亡(Hahn WC，et al.Nat Med 199951164-70)，但该功能域突变体对有“癌中之王”之称的肝癌的端粒酶活性及其恶性行为的影响在国际上却无报道。 根据Medline的检索，目前并无任何有关采用人端粒酶反转录酶样组分的基因突变体进行临床治疗肝癌的研究的报道。查到有关telomerase和catalytic and mutant的文献18篇，其中涉及肝癌的研究为0篇。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种人端粒酶反转录酶样组分的基因突变体的新用途，特别是其在制备治疗肝癌的药物中的应用。该基因突变体的基因顺序包括在端粒酶反转录酶样组分各保守结构域的各种可能的突变顺序；该基因突变体的突变方式是点突变；该基因突变体的基因序列为<210>1中所述序列；该基因突变体的载体为真核表达质粒或核酸病毒；该核酸病毒为反转录病毒或腺病毒；所述药物的给药方式为静脉注射或肌肉注射。 在BEL-7404人肝癌细胞中表达端粒酶反转录酶组分的功能域突变体后，由于该突变体可以与野生型的端粒酶反转录样组分发生竞争，因而可以有效抑制其端粒酶活性，表达DN-hTERT的BEL-7404人肝癌细胞的端粒长度随着细胞分裂的进行逐渐缩短，而表达野生型的反转录酶组分(wild typehTERT，WT-hTERT)和空白载体对照的细胞则没有这样的变化；DN-hTERT表达细胞的生长受到抑制，抑制程度与端粒酶活性的抑制水平相关，但WT-hTERT表达细胞的生长与对照细胞相比则几乎没有变化；DN-hTERT表达细胞在细胞传代培养的后期，细胞膨胀变大；当DN-hTERT表达细胞的端粒长度达到极限短时(大约1.7Kb)，细胞发生凋亡；裸鼠成瘤性实验结果显示，DN-hTERT表达细胞的裸鼠成瘤性消失。上述结果表明，端粒酶的反转录酶组分对肝癌细胞的生长是必需的，是肝癌基因治疗和抗肝癌药物筛选的理想靶点。 我们又将端粒酶的反转录酶组分的基因点突变体对载人肝癌的裸鼠模型进行了实验治疗，结果令人满意。并在实验动物中证明了端粒酶反转录酶组分的功能域突变体能够使人肝癌细胞的成瘤性消失。上述结果表明通过基因点突变构建的端粒酶的反转录酶组分的功能域突变体作为一种治疗人类肝细胞肝癌的新药是完全值得的。 附图说明 图1表示出外源的hTERT基因(DN-hTERT或WT-hTERT)对BEL-7404人肝癌细胞端粒酶活性的影响。 其中1-裂解液阴性对照 2-BEL-7404母细胞对照3-Vector对照 4-WT-hTERT表达克隆25-WT-hTERT表达克隆3 6-WT-hTERT表达克隆87-DN-hTERT表达克隆1 8-DN-hTERT表达克隆39-DN-hTERT表达克隆4 10-DN-hTERT表达克隆8图2表示出外源的hTERT基因(DN-hTERT或WT-hTERT)对BEL-7404人肝癌细胞端粒长度的影响。 其中1，7-Ma本文档来自技高网...
【技术保护点】
人端粒酶反转录酶样组分的基因突变体在制备治疗肝癌的药物中的应用。
【技术特征摘要】
1.人端粒酶反转录酶样组分的基因突变体的应用，其特征在于，用于制备治疗肝癌的药物，且该基因突变体的突变方式为点突变，具有SEQ ID NO1所示的基因序列。2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，该...
【专利技术属性】
技术研发人员：谢弘，张如刚，郭立霞，李隽哲，来文，
申请(专利权)人：中国科学院上海细胞生物学研究所，
类型：发明
国别省市：31[中国|上海]
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