保存病毒和支原体的方法技术

不经冻干在残留水分含量不超过２％的玻璃样海藻糖基质中，通过干燥保存含有活病毒或支原体的生物活性材料。该方法包括两个真空干燥阶段。在比经典冻干法短得多的一个周期时间内，可以保存病毒或支原体以提供能够通过重新水化产生有效疫苗的材料。（*该技术在2020年保护过期，可自由使用*）

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及病毒和支原体的保存。具体地，本专利技术涉及一种采用二糖，即海藻糖，保存这些材料的超快方法。通过该方法，可以实现对病毒和/或支原体的长期保存，尤其是可以制备减毒活疫苗。通过脱水和渗透浓缩保存生物可降解材料是一项普通的古老技术。当必需保存敏感生物分子时，通过脱水进行的简单干燥将无法胜任此任务，因为结构水的除去会引起随后的变性和生命活性的丧失。在液氮中低温贮藏和冻干已被接受为长期保存敏感生物分子的方法，后一种方法被广泛用于保存减毒活疫苗。通过延长第二个冻干周期以便使残余水分(RM)减少至大约1％-2％，已经实现了对冻干牛瘟疫苗耐热性的提高。按Mariner，J.C.等，Vet.Microbiol.，1990，21，195-209所描述的，这需要长达72小时的长时间和高能量消耗操作周期。由此方法制备的疫苗称作“THERMOVAX”，而与标准疫苗区分开。正如以上提及的，目前使用的这些方法均耗时，并涉及高能量的投入。而且，冻干仅赋予终产品中等水平的耐热性，而且仍需要冷藏降低贮存过程中的变质。对于在热带气候下使用的活疫苗而言，这尤其是一个问题，因为这些疫苗会丧失效力而导致失败的结果，即在难于监测“冷链(cold chain)”的热带国家中野外实施的接种计划将最终导致给患者接种低标准或，在某些情况下，无效的疫苗。在进化的自然选择过程中，某些植物和动物物种获得了出色而精巧的耐受极度脱水的能力，以致可以在有害环境中极长时间地保持休眠，并能在重新水化后仍具有完全的生命活性。实例包括更苏植物鳞叶卷柏(Selaginella lepidophyla)、海虾Artemia salina(Clegg，J.，J.Comp.Biochem.Physiol.，1967，20，801-809)、酵母类酿酒酵母(Sachharomyces cerevisiae)(Coutinho，E.，生物技术杂志(Journal ofBiotechnology)，1988，7，23-32)、和缓步动物Macrobiotus hufelandi(Kinchin，I.M.，生物学家(Biologist)，1995，42，4)。这些生物被称为隐生的，而它们存活的方法被称作低湿生活。所有表现出此能力的动物和植物物种都含有二糖海藻糖(α-D-吡喃葡糖基-α-D-吡喃葡糖苷)。海藻糖在大多数隐生生物中一般以约0.2g/g细胞干重的量存在，这使得这些生物可以抵抗极度脱水、高温、X-射线，以及在一些缓步动物物种中还可以抵抗高达600Mpa的压力。Colaco等，生物技术(Biotechnology)1992，10，1007-1011，描述了采用海藻糖快速干燥生物材料的益处。该方法主要涉及在预先形成的基质例如纤维素纤维上，或在用于诊断目的例如ELISA或实验室中类似诊断应用的塑料板表面上，干燥限制性酶和免疫球蛋白。然而，当上升至工业应用时，例如大规模的商业疫苗生产，由于必需在部分密封的小瓶中采用必需的无菌技术操作大得多的单位数量和体积，这些技术产生多个问题。为了满足大规模疫苗生产的操作要求，即典型的1.0ml以上的单位体积和20升的生产批量，需要一个不同的策略以在经济上可接受的时间内除去这种体积的水。在大气压力下，即使在最高的生理耐受温度下进行干燥也将需要一段无法接受的长时间以足够快地从部分塞住的疫苗小瓶中除去水分，而且将不可避免地导致变性和效力的丧失。本专利技术涉及在可除去水分同时允许保持病毒或支原体材料的生物学完整性的条件下，采用海藻糖保存这些材料的方法。因此，本专利技术提供含有活病毒或支原体的生物活性材料的保存方法，该方法包括步骤(i)将该生物活性材料的水悬液与海藻糖的无菌水溶液混合，以使该混合物中的海藻糖浓度在0.2-10％w/v范围内；(ii)在低于大气的压力下，在温度最初不超过37℃，并且被控制不降低至0℃或更低，最终不超过40℃的条件下，对该混合物进行第一次干燥，时间为30-60分钟，以形成含有玻璃样海藻糖、残留水分含量不超过10％的玻璃样多孔基质，在该基质中含有干燥的生物活性材料；和(iii)在不超过0.1mbar的压力下，在温度最终处于40-45℃范围内的条件下，对步骤(ii)的玻璃样多孔基质进行第二次干燥，其10-30个小时，以形成含有干燥生物活性材料的、残留水分含量不超过2％的海藻糖基质。通过采用本专利技术的方法，可以制备与现有方法相比具有增强的生物学特性和突出的商业优点的活疫苗。采用本专利技术方法制备的疫苗比采用常规冻干方法制备的疫苗其干燥速度要快得多。例如，可以采用本专利技术方法在不到1小时内干燥海藻糖/生物活性材料混合物，使其含水量达到约10％。并可以在不足30个小时，例如约20小时的时间内，实现进一步脱水，使残留水分含量为约1-2％，而常规冻干方法需要50个小时。而且，根据本专利技术可使由于溶质浓缩造成的损伤最小化，尤其是避免了损伤性冰晶形成。保存在该海藻糖玻璃样基质中的生物活性材料的热稳定性比按现有方法保存的材料的热稳定性高，由此，对常规冻干疫苗是一个严重限制的“冷链”，其必要性被最小化。本专利技术的产品可以更长时期地暴露于高环境温度例如高达约45℃下，而生物学活性基本上没有损失。除了本专利技术的这些和其它优点外，本专利技术方法制备的产品当重新水化时还表现出即刻“速溶性”。本专利技术的方法适于长期保存病毒和支原体。尤其是，可以采用本专利技术方法保存可以重新水化形成疫苗的高不稳定性减毒活病毒成分和支原体成分。可以根据本专利技术方法保存的这些生物活性材料的实例包括科副粘病毒科(Paramyxoviridiae)亚科Paramyxovirinae属副流感病毒组麻疹(Measles)、牛瘟(Rinderpest)、犬瘟热(caninedistemper)、小反刍动物瘟疫(Peste des Petits Ruminants)(PPR)副粘病毒属(Paramyxovirus)腮腺炎病毒(流行性腮腺炎)属风疹病毒(Rubivirus)，病毒性风疹(Rubella)(德国麻疹(GermanMeasles))属黄病毒(Flavivirus)，黄热病毒(Yellow fever virus)(黄热病)属弹状病毒(Rhabdoviruses)，Lyssaviridiae(狂犬病病毒(Rabiesvirus))细小核糖核酸病毒(Picorna viruses)(脊髓灰质炎病毒(Poliovirus))新城疫病毒(Newcastle Disease virus)支原体Mycoplasma mycoides(牛接触感染性胸膜肺炎)流产布鲁氏菌(Brucella abortus)第19株疫苗衣原体Chlamydia psittaci(地方性动物病流产(Enzooticabortion))CorridiaToxoplasma gondii(弓形体病)根据本专利技术的方法，将待保存的生物活性材料在适当的水性介质中配制成悬液。对于病毒，可能需要例如在非洲绿猴肾细胞系上于适当的培养基中对其进行培养，然后在悬浮前收获以便提供有用浓度的材料。典型地，例如通过加入碱，调节生物活性材料水悬液的pH至7.0-7.8范围内，尤其是约7.4。海藻糖是最稳定的化学上不反应的二糖之一。其具有小于1Kcal/Mol的本文档来自技高网...

【技术保护点】
含有活病毒或支原体的生物活性材料的保存方法，该方法包括步骤：（ｉ）将该生物活性材料的水性悬液与海藻糖的无菌水溶液混合，以使该混合物中的海藻糖浓度在０．２－１０％ｗ／ｖ范围内；（ｉｉ）在低于大气的压力下，在温度最初不超过３７℃，并且被 控制不降低至０℃或更低，最终不超过４０℃的条件下，对该混合物进行第一次干燥，时间为３０－６０分钟，以形成含有玻璃样海藻糖、残留水分含量不超过１０％的玻璃样多孔基质，在该基质中含有干燥的生物活性材料；和（ｉｉｉ）在不超过０．１ｍｂａｒ的压 力下，在温度最终处于４０－４５℃范围内的条件下，对步骤（ｉｉ）的玻璃样多孔基质进行第二次干燥，时间为１０－３０个小时，以形成含有干燥的生物活性材料的、残留水分含量不超过２％的海藻糖基质。

【技术特征摘要】
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【专利技术属性】
技术研发人员：埃里克爱德华沃勒尔，
申请(专利权)人：埃里克爱德华沃勒尔，
类型：发明
国别省市：GB[英国]