疫苗的生产制造技术

技术编号:1724745 阅读:236 留言:0更新日期:2012-04-11 18:40
本发明专利技术提供了生产哺乳动物病毒的新手段和方法,包括用病毒感染无限增殖化的人类细胞培养物,在允许病毒生长的条件下温育用病毒感染的培养物以繁殖病毒,形成含有病毒的培养基,以及获取含有病毒的培养基。可以收获病毒并用于生产疫苗。本发明专利技术的优点是,本发明专利技术的人类细胞可以在规定无血清条件下培养,并且所述细胞显示改进的繁殖病毒的能力。具体地,提供了在培养的人类细胞中生产流感病毒的方法及其衍生的疫苗。这一方法无需使用全鸡胚生产流感疫苗。这一方法还可以连续或分批获取培养物培养基。因此,本发明专利技术使得可以大规模连续生产高滴度病毒。(*该技术在2020年保护过期,可自由使用*)

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】
本专利技术涉及疫苗的研制和生产。本专利技术特别涉及病毒蛋白和/或病毒的生产领域,尤其涉及使用哺乳动物细胞、优选人体细胞生产生长于真核细胞动物优选哺乳动物特别优选人体细胞中的病毒。本专利技术特别实用于疫苗的生产,以有助于脊椎动物,尤其哺乳动物特别是人对病毒病原体的抵抗力。本专利技术揭示了优选使用一种已知成分合成培养基在人体细胞中产生病毒和/或病毒蛋白,以及从细胞或培养基中纯化病毒或其组分的手段和方法。本专利技术还提供了含有病毒或其组分的药物组合物,及生产和回收和/或纯化它们的方法。
技术介绍
接种是对付病毒感染的一条最重要的途径。尽管已有许多抗病毒制剂,但这些制剂的效力有限。一旦个体被感染(被动免疫),施用抗病毒的抗体也许是一种对付病毒感染的良好方式,而且典型地人抗体或人源化抗体确实有希望对付一些病毒感染,但对付病毒感染的最安全有效的方式是并也许是通过主动免疫进行预防。主动免疫一般是指进行接种,而且疫苗包含典型地一种病毒的至少一个抗原性决定簇,优选包含至少一种病毒或其它病原体的多个不同的抗原性决定簇,例如通过将产生自病毒的至少一种(病毒)多肽或蛋白掺入疫苗中(亚单位疫苗)。典型地上述形式的疫苗包括佐剂以增强免疫应答。还可以是基于整个病毒(病原体)的疫苗,例如灭活形式的疫苗。另一种可能形式是使用活的但减毒形式的病原性病毒。另一种可能形式是使用野生型病毒,例如在成熟个体不受感染的威胁,但通过母体抗体对婴幼儿也许有保护作用的情况中。疫苗的生产不总是一种简便的步骤。在一些情况中,病毒材料是在鸡蛋中生产的,这导致难以纯化材料和对污染物进行深入的安全性控制等。另外,有时但不经常是作为在鸡蛋中生产的替代的在细菌和或酵母上的生产也需要许多纯化和安全步骤。在哺乳动物细胞上生产是另一种替代方式,但所用的哺乳动物细胞均需要例如存在血清和/或粘着于固体支持物以生长。在第一种情况中,同样,纯化和安全性及例如蛋白酶的需要以支持一些病毒的复制成为一个问题。在第二种情况中,高产量和便利性成为另一个问题。本专利技术克服了现有技术中至少一些与用于疫苗的病毒和/或病毒蛋白的生产系统相关的问题。专利技术详述本专利技术揭示了一种新的用以增殖和收获病毒的人体无限增殖化细胞系,以生产所述病毒。PER.C6细胞(WO97/00326)是通过使用含有在人磷酸甘油激酶(PGK)启动子控制下的Ad血清型5(Ad5)E1A-和E1B编码序列(Ad5核苷酸459-3510)的质粒转染原代人胚胎视网膜细胞产生的。以下特点使PER.C6或其衍生物特别适用作产生病毒的宿主其是一种充分定性的人体细胞系,其是顺应GLP开发的,其可以在已知成分无血清培养基中作为悬浮培养物生长,没有任何人或动物血清蛋白;其生长与滚瓶,摇瓶,旋转瓶和生物反应器相适应,倍增时间为大约35小时。流感流行病学流感病毒,正粘病毒科的成员,是急性呼吸道疾病年度流行的致病因素。仅在美国每年就有5千万美国人染上流感。估计全世界的死亡人数(1972-1992)为60000(CDC统计)。有3次全世界流行性流感爆发,1918年(西班牙流感,估计4千万人死亡),1957年(亚洲流感,估计1千万人死亡),和1968年(香港流感,估计70000人死亡)。流感病毒感染与许多疾病和并发症相关,导致实质上世界范围发病率和死亡率,尤其在患有慢性疾病的老人和病人中。抗流感接种在预防与这种感染相关的通常致命的并发症中是最有效的(Murphy,B.R.和R.G.Webster,1996)。已经报道了在二倍体人体细胞系MRC-5上生产流感病毒(Herrero-Euribe L等,1983)。然而,流感病毒的效价非常低。流感病毒毒株目前流感疫苗含有流感病毒A和B的纯化的血凝素和神经氨酸酶。代表流行病学重要的毒株的3种病毒是流感病毒A(H1N1),流感病毒A(H3N2)和流感病毒B。将流感病毒分为A和B型是基于其核蛋白(NP)和基质(M)蛋白抗原之间的抗原性差异。流感病毒A还可基于血凝素(H1-H15)和神经氨酸酶(N1-N9)分子的抗原性组分(序列)进一步分为亚型。这些亚型的每一种代表物均已经从水栖鸟类中分离,其可能是鸟类和哺乳动物物种的所有流感病毒的原始储存宿主。已经示出在猪和人之间的传染性,近来示出了在鸟和人之间的传染性(H5N1)。流感疫苗目前在世界通用的3种灭活的流感疫苗是全病毒,片段疫苗和表面抗原或亚单位疫苗。这些疫苗均含有预期在随即的季节中将要在人群中传播的流感病毒毒株的表面糖蛋白,血凝素(HA)和神经氨酸酶(NA)。将这些掺入疫苗中的毒株在含胚卵中生长,并随后在进一步加工之前纯化病毒颗粒。需要逐年调整流感疫苗是因为由已知称为“抗原性漂移”和“抗原性转变”所致的抗原发生变化。“抗原性漂移”是由于在病毒的H或N蛋白中积累一系列点突变而发生的,导致氨基酸取代。这些取代防止由各种感染产生的中和抗体的结合,而且新变体可以感染宿主。“抗原性转变”是通过在动物和人流感病毒A之间进行遗传重配而出现一种新的亚型。1957年(H2N2)和1968年(H3N2)的全世界流行性毒株例如是重配的病毒,通过其鸟类H或N基因导入循环的人体病毒中,随后可以在人群中传播。基于对一百个以上的国际流感病毒中心的流行病学监测,世界卫生组织(WHO)每年常在2月对北半球,在9月对南半球推荐一些流感疫苗组合物。这种惯例限定了疫苗产生和标准化的时间窗,最大为9个月。在急需大剂量疫苗的情况中,例如当流感病毒A的一种新亚型通过抗原性转变和抗原性漂移产生时,鸡蛋的有限资源可能妨碍疫苗的快速生产。这种生产系统的另一个缺点是适应性差,有存在毒素的风险和存在外来病毒尤其逆转录病毒的风险,并关系到不育性。目前在含胚卵上生产流感疫苗的实践存在严重问题。因此,使用生产流感疫苗的一种细胞培养系统是具有吸引力的另一种选择。可以将流感病毒在许多原代细胞,包括猴肾,小牛肾,仓鼠肾和小鸡肾细胞上培养。但还未将它们实际用于生产疫苗,因为为制备疫苗,需要从这些原代细胞中重建培养物。因此,使用生产流感疫苗的持续性无限增殖化细胞系是另一种有吸引力的选择。认识到HA蛋白酶解成其两个亚单位(HA1和HA2)是流感病毒感染性所需的,并可以通过加入胰蛋白酶而获得这一点有助于应用培养系统。包涵胰蛋白酶允许在Madin-Darby犬肾(MDCK)细胞中复制并形成噬斑(Tobita等,1975)。近来示出MDCK细胞系支持用以生产疫苗的流感病毒生长,(Brand等,1996和1997,Palache等,1997)。使用胰蛋白酶需要MDCK细胞在无血清的组织培养基(MDCK-SF1)中生长。然而,MDCK细胞目前未经认可用作生产流感病毒的底物。重要地是,任何生产流感疫苗的非人系统具有已知为“适应性”的固有的缺点。由于在含胚卵中的适应性,人流感病毒A和B均携带HA中的突变。这些突变导致抗原性改变(Newman等,1993,Williams和Robertson 1993,Robertson等,1994,Gubareva等,1994,Schild等,1993,Robertson等,1987,Kodihalli等,1995)。在人体中,用含有并携带适应含胚卵引起突变的HA的疫苗进行免疫,产生较少的对含有非含胚卵适应的HA的病毒的中和抗本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种生产用作疫苗的非腺病毒或腺病毒蛋白的病毒和/或病毒蛋白的方法,包括提供一种细胞,其具有至少一个编码至少一种腺病毒的E1基因的基因产物或其功能衍生物的序列,将编码所述病毒和/或所述病毒蛋白的核酸提供给所述细胞,将所述细胞在适当培养基中培养并使所述病毒和/或病毒蛋白表达,以及从所述培养基和/或所述细胞中收获所述病毒和/或病毒蛋白。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】...

【专利技术属性】
技术研发人员:玛丽亚格拉齐亚波阿方萨斯赫拉尔杜斯科内利斯玛丽亚霍弗特约翰斯豪滕
申请(专利权)人:克鲁塞尔荷兰公司
类型:发明
国别省市:NL[荷兰]

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