核酸疫苗接种的改进制造技术

一种核酸疫苗构建体，其中含有分离的多核苷酸，它编码来自Ｍｕｃｌ的ＶＮＴＲ单体的含至少５个连续氨基酸残基的一段多肽，其中一或多个所述氨基酸是糖基化位点，其特征在于当所述分离多核苷酸在哺乳动物细胞中表达时，所得多肽的糖基化在至少一个所述糖基化位点被改变或阻止。（*该技术在2020年保护过期，可自由使用*）

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】
本专利技术涉及含分离多核苷酸的核酸疫苗构建体，其编码的多肽是MUC1蛋白的糖基化变体，含该构建体的疫苗组合物及构建体或组合物用于接种哺乳动物的用途。
技术介绍
上皮细胞粘蛋白MUC1(也称为episialin或多形性上皮粘蛋白)是一种表达于多种上皮细胞的大分子量糖蛋白。该蛋白由细胞质尾、跨膜结构域和不同数目的20个氨基酸基序串联重复(此处称为VNTR单体，也可称为VNTR表位、或VNTR重复)组成，VNTR中含有高比例脯氨酸、丝氨酸和苏氨酸残基。由于MUC1基因座的遗传多态性致使重复数目可变，最常见的范围是30-100个重复(Swallow et al.，1987，Nature 32882-84)。正常管腔上皮中，MUC1蛋白仅发现于细胞的顶面，暴露于管腔(Graham et al.，1996，Cancer Immunol Immunother4271-80；Barratt-Boyes et al.，1996，Cancer ImmunolImmunother 43142-151)。MUC1分子最显著的特征之一是其高度O-连接糖基化。每个MUC1 VNTR单体上有5个O-连接糖基化位点。根据附图说明图1的编号系统，它们是Thr-6、Ser-7、Thr-11、Ser-17和Thr-18。由这些上皮细胞向肿瘤转化形成的恶性癌中的几个变化影响了MUC1的表达。蛋白的极性表达丢失，可在转化细胞的全部表面发现其分布。MUC1的总量也增加，经常是10倍或更多(Strous & Dekker，1992，Crit Rev Biochem Mol Biol 2757-92)。最明显的是，O-连接糖链的量和质都有很大变化。丝氨酸和苏氨酸的糖基化变少，糖链也异常的缩短，形成肿瘤相关的糖抗原STn(Lloyd et al.，1996，J BiolChem，27133325-33334)。作为糖基化改变的结果，MUC1肽链上原来被糖链掩蔽的多种表位变得可以接近。以此方式变得可以接近的一种表位由每20个氨基酸的VNTR单体上存在的序列APDTR(图1中Ala8-Arg 12)组成(Burchell et al.，1989，Int J Cancer44691-696)。很明显MUC1的这些改变意味着可激活免疫系统，对抗肿瘤表达MUC1形式的疫苗可有效对抗上皮细胞肿瘤、以及事实上表达MUC1的其它细胞类型，如T淋巴细胞。免疫系统杀死表达异常蛋白的细胞的一种主要作用机制是细胞毒性T淋巴细胞(CTL’s)免疫应答，且在治疗肿瘤的疫苗中，像抗体应答一样，也需要这种应答。一种好疫苗将激活免疫应答的所有方面。然而，目前的糖和肽疫苗如Theratope或BLP25(Biomira Inc，Edmonton，Canada)优先激活免疫应答的一个方面，分别激活体液和细胞免疫，更优的疫苗设计需要产生更平衡的应答。核酸疫苗提供优于传统蛋白疫苗的多种益处，因为它们便宜且容易大量生产。已有报道甚至小剂量即可诱导强免疫应答，且在诱导抗体免疫应答的同时可诱导细胞毒性T淋巴细胞应答。然而，技术障碍阻止了有效对抗MUC1的核酸疫苗的开发。在核酸疫苗接种中，编码所选抗原的核酸分子被引入宿主的正常细胞。如果编码MUC1多肽的核酸疫苗以颗粒介导的基因转移方式递送(美国专利5371015)，转染频率最高的细胞可能是角质细胞或皮肤朗氏细胞。与之相似，如果核酸由肌内注射递送，骨骼肌细胞和骨髓起源的抗原呈递细胞是主要的靶细胞类型。这些细胞的每种都包含糖基化酶的生理平衡，由此将糖基化由疫苗编码的MUC1基因产物，以此方式使之与正常上皮细胞中的MUC1更相似，而不是转化细胞中发现的异常糖基化形式。事实上，几乎所有用编码MUC1的多核苷酸转染的细胞将糖基化该疫苗编码的基因产物。因此，仅管可以见到一些效果，疫苗不能最佳刺激抗肿瘤细胞的免疫。因此，本专利技术提供编码含VNTR单体或其重复或其片段多肽的核酸疫苗接种构建体，它已经被操作使编码序列不能被正常细胞机制完全糖基化。令人惊奇的是，通过在编码多肽中制造新的氨基酸取代，本专利技术者在一方面已经设法达到此要求。专利技术人已制造出核酸疫苗接种构建体，其所含多核苷酸编码的多肽保留了MUC1的构象，这是变化多肽保持免疫原性的基本要求，并且其糖基化降低，因此更接近于肿瘤中表达的MUC1形式。专利技术概述根据本专利技术的一个实施方案，已提供了一种核酸疫苗构建体，它所含分离的多核苷酸编码的多肽含有来自MUC1的VNTR单体的至少5个连续氨基酸残基，其中包括一或多个糖基化位点，其特征在于所述多肽包含至少一个氨基酸突变，该突变在至少一个所述糖基化位点阻止或改变糖基化。一方面，由本核酸疫苗构建体编码的多肽由一个拷贝的MUC1 VNTR单体构成。另一方面，由本核酸疫苗构建体编码的多肽由MUC1 VNTR单体的一个片段组成。在本专利技术的进一步实施方案中，提供了一种疫苗组合物，其中含有如此处定义的一种核酸疫苗接种构建体，并组合有可药用的载体。在本专利技术的另一实施方案中，提供了如此处定义的一种核酸疫苗接种构建体或疫苗组合物，它们用于哺乳动物抗肿瘤疫苗接种。另外在本专利技术另一实施方案中，提供了如此处定义的一种核酸疫苗接种构建体或疫苗组合物在制造用于哺乳动物抗肿瘤疫苗接种的药物中的用途。在本专利技术另一实施方案中，提供了一种哺乳动物抗肿瘤疫苗接种的方法，包括向所述哺乳动物施用此处定义的一种核酸疫苗接种构建体或疫苗组合物。附图简述本专利技术将进一步通过实施例的方式描述，并参考以下附图图1表示一种MUC1 VNTR单体元件(此处称VNTR)的野生型氨基酸序列。图2表示由优选的分离多核苷酸编码的一种称为Mut5I的多肽序列，本专利技术的一种核酸疫苗接种构建体含有该多核苷酸。与野生型序列对应的突变表示为黑体。图2也包括编码该多肽的一种代表性核苷酸序列。图3表示由优选的分离多核苷酸编码的一种称为Mut5V的多肽序列，本专利技术的一种核酸疫苗接种构建体含有该多核苷酸。与野生型序列对应的突变表示为黑体。图3也包括编码该多肽的一种代表性核苷酸序列。图4表示在一系列抗体浓度范围内，结合到野生型MUC1多肽及表1所示的突变多肽上的抗体。这些结果证明抗体SM3(它识别8-13位残基的APDTRP基序)识别未糖基化多肽的能力。Mut5P、Mut5A和Mut5N表现出与Mut5W基本相同的结果。图5表示用于产生包含Muc1突变形式的核酸疫苗构建体的克隆策略。图6用编码MUC1突变形式的核酸疫苗构建体免疫小鼠得到抗体血清。该图表示该血清结合到合成肽形式的野生型MUC1上。这表明本专利技术的核酸疫苗构建体可在体内产生识别未突变MUC1形式的抗体。图7表示来自编码MUC1突变形式的核酸疫苗构建体免疫小鼠的抗体血清结合到人乳腺癌细胞上的FACS分析。这些结果表明本专利技术的核酸疫苗构建体可在体内产生识别肿瘤表达MUC1形式的抗体。图8表示实施例3中描述的pVAC1-stc的N端部分的序列。图9表示用于构建如实施例3所示的MUT4突变MUC1质粒的寡核苷酸。所有序列都是从5’到3’。划线部分指出限制性位点，斜体表示用作短PCR引物的序列。小写字母表示编码期望突变必需的不同于野生型序列的部分。符号“A上部”、“A下部”等指图本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种核酸疫苗构建体，其中含有分离的多核苷酸，它编码的多肽含有来自Ｍｕｃ１的ＶＮＴＲ单体的至少５个连续氨基酸残基，其中一或多个所述氨基酸是糖基化位点，其特征在于当所述分离多核苷酸在哺乳动物细胞中表达时，所得多肽的糖基化在至少一个所述糖基化位点被改变或阻止。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】...

【专利技术属性】
技术研发人员：JS克罗维，JH埃利斯，
申请(专利权)人：葛兰素集团有限公司，
类型：发明
国别省市：GB[英国]